habe heute eine TCA/ Acetonfällung mit meinen Proben gemacht. Nach der TCA-Fällung hatte ich fette Pellets. Nach dem ersten Waschschritt mit Aceton waren diese leider weg. Jemand eine Idee? Ist das Waschen mit Aceton oder ähnlichem zwingend notwendig?
Hast du die Temperatur für das Aceton auch eingehalten?Das Waschen ist notwendig,
um die überschüßige TCA wieder zu entfernen.Normalerweise wird das Pellet beim ersten Mal in Aceton suspendiert,um auch sämtliche TCA in Lösung zu bringen,das Pellet sollte sich dabei nicht lösen.Schau noch mal genau in dein Protokoll,ob auch die Bedingungen eingehalten wurden.
Wieviel Protein wurde eingesetzt?
Eine starke Trübung (-> milchig) muss nicht heißen, dass das auch viel Protein ist; je nach Puffer fallen da auch Detergentien o.ä. mit aus.
Das Aceton war evtl. noch nicht ganz kalt (keine -20), sicher aber unter Null. Vermute aber auch das hier das Problem lag, da bei meiner ersten TCA/Aceton Fällung alles gut ging.
Wie viel Protein eingesetzt wurde ist schwer zu sagen, das es sich um die Elutionen aus einem Pull Down Essay handelte. Es wurden pro Elution 50µl GST Sepharose eingesetzt und mit 1ml eluiert.
Da es schon mal funktioniert hat werde ich es einfach nächste Woche nochmal versuchen. Schade nur das man um die Waschschritte nicht herum kommt.
Danke euch für die Antworten.
Das ist aber ganz schön viel Elutionspuffer für 50 µl Beads (ich nehm an, du meinst Glutathion-Sepharose). Ist auch eigentlich nicht nötig; wenn du 5-6 mal mit je dem halben Säulenvolumen eluierst (30 mM GSH), kriegst du eigentlich >90 % runter. Aber gut, das nur nebenbei.
...oder direkt mit Lämmli, dann brauchste auch keine TCA-Fällung
Linear-Darstellung
