Ich habe das Gefühl, dass hier einige Sachen durcheinander gehen.
Natürlich kann es innerhalb eines einzelnen DNA-Stränges zu Interaktionen kommen, sofern die Temperatur niedrig genug ist und hinreiched komplementäre Sequenzen innerhalb der DNA vorhanden sind. Solche Sekundärstrukturen sind aber praktisch weniger bedeutsam.
Bei PCR-Reaktionen geht man ja meist von doppelsträngiger DNA als
template aus. Dieses wird auf 95°C (teilweise 98°C) erhitzt und die komplementären Stränge aufgetrennt. Selbst wenn von man einzelsträngige DNA (z.B. einzelsträngige cDNA) ausgeht hat man diesen Erhitzungsschritt. Dann wird die Temperatur erniedrigt, um ein Zusammenlagern von komplementären Sequenzen zu erreichen. Dieser
Anneling-Schritt findet größenordnungsmäßig bei 60°C statt. Es mag DNA-Stücke mit sehr langen komplementären Sequenzen innerhalb des gleichen Stranges geben, bei denen es auch bei 60°C noch zu Seundärstrukturen kommt, die Regel ist das aber sicherlich nicht.
Zur Temperatur und Spezifität:
Manchmal geht man nicht von einer definierter
template-DNA aus, sondern hat genomische DNA oder cDNA-Mischungen hat. Im Prinzip kann ein Primer dann nicht nur an den gewünschten Bereich binden, sondern auch an andere Bereiche, die eine ähnliche (aber nicht identische) Sequenz aufweisen. Da man aber innerhalb eines solchen Bereiches auch unterschiedliche Basen hat, ist die Paarung nicht perfekt, es können nicht so viele H-Brücken ausgebildet werden. Damit muss man weniger Kraft aufwenden, um den Primer vom "falschen" Bereich zu lösen, als um ihn von dem Bereich zu lösen, wo er perfekt passt. Anders gesagt ist die Schmelztemperatur für eine perfekte Paarung höher, als bei einer nicht-perfekten Paarung (an einen nicht ganz komplementären Bereich).
Wenn man nun die
Anneling-Temperatur hoch genug wählt, kann ein Primer nur an den genau richtigen Bereich binden und man amplifiziert genau diesen Bereich selektiv. Auf der anderen Seite muss die Temperatur natürlich niedrig genug sein, damit der Primer überhaupt binden kann.
Zitat:
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Mit steigender Temperatur nimmt die Spezifität ab, das ist tatsächlich ähnlich wie bei der PCR. Bei uns wird zum Biespiel öfter mal über nach bei 4°C inkubiert.
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Das hat ganz andere Ursachen.
Wenn man ein PCR-Produkt z.B. für eine Klonierung braucht, wird es ja nach der PCR aufgereinigt und dann meist direkt verwendet oder eingefroren. Da es aber nicht immer bequem ist, auf seine PCR zu warten und die am Ende aufzuarbeiten, setzt man ans Ende der PCR einen Schritt von 4°C, bei der Temperatur ist die DNA stabil und die Polymerase macht auch keinen Unsinn. Die Maschine kühlt das Reaktionsgemisch auf 4°C und hält das so lange, bis man was anderes einstellt. Damit kann man abends noch PCRs pipettieren, wenn die Reaktion fertig ist bleibt alles bei 4°C und am nächsten Morgen kann man die Proben aus der Maschine nehmen. Das hat also nichts mit Spezifität zu tun, sondern ist nur bequem für den Experimentator.
Gruß,
Zara
Linear-Darstellung
