Dringende Hilfe für Chlororformalternative

[Vektor 23]

Hallo, ich habe nächste Woche das wundervolle Vergnügen ein eigenen Versuch zu gestallten wie ich DNA aus Käse und Fett herausbekomme.
Am Anfang war das für mich kein Problem, da ich mit dem Gedanken gespielt habe Phenol/Chloroform einzusetzten.

Nun ist das Problem, dass meine Dozentin Chloroform vermeiden will, sprich es darf nicht genutzt werden.

Nun überlege ich, wie ich sowohl das Fett als auch die Proteine von der DNA herausbekomme ohne das meine DNA mit irendwelchen Reagenzien geagiert oder sogar die DNA zerstört wird.

Um das Fett loszuwerden, sind mir nur ertsmal 1 Reagenz eingefallen:

1. Das Lowry Reagenz( oder auch Folin- Ciocalteau Reagenz)
- damit möchte ich versuchen, das mein Fett mit dem Reagenz prezipiert und ich dann den Überstand, mit der evtl entaltende DNA, abnehmen kann.
Danach könnte man ja die Proteine entfernen (noch soviel dazu)


Um die Proteine zu entfernen schbeben mir 3 Möglichkeiten:

1. mit erhitzen, aber noch so das meine DNA nicht ausfällt,sprich 60 bis 75°C
damit meine Proteine denaturieren und ausfallen.
oder Ich erhitze zur Sicherheit bis 90°C lass es aber langsam wieder abkühlen, so dass sich die DNA Stränge wieder vollständig richtig anlagern.


2. Mit SDS die Proteine denaturieren. Dabei hab ich mir sogar gedacht, da es ja ein Tensid ist könnte es meine Fetttröpfchen verkleinern, so dass sie später an der Oberfläche des Wassers schwimmen und ich alles unterhalb der fettschicht abnehme, um an die DNA zu kommen.

3. Dann hab ich mir noch gedacht die Proteine mit NaCH3COO auszusalzen.
ich weiß aber dann nicht ob er mir alle Proteine aussalzen wird.

Ich werde zur sicherheit natürlich regelmäßig eine photometrische Reinheitsmessung machen.


So das waren meine Überlegungen, ich hoffe Jemand kann mir einige Korrekturen zu meinem Versuch erzählen, die ich vllt. noch übersehen habe, Ich würde mich sehr freuen.


Euer Vektor 23

[Vektor 23]

Kann mir wirklich Keiner mir auf die Sprünge helfen?

[heulboje9181]

Also Wir haben in unserem Labor immer das Azetrope Gemisch aus Cyclohexan und Ethylacetat verwendet (ca 1:1), das hatte super zur Fettextraktion geklappt.

[Vektor 23]

Und das reagiert nicht mit der noch zusätzlichen enthaltenden DNA?
Mal schauen ob ich damit arbeiten darf,wenn es nicht die gleiche gefahrensstufe hat wie Chloroform, dann lässt sie das vllt gälten

[zarathustra]

Mit einigen Ausnahmen ist es doch inzwischen Standard, Kits für die Isolierung von genomischer DNA zu verwenden. Dabei werden Gewebeproben über Nacht in einem Lysis-Puffer mit Proteinase K behandelt, um die Proteine zu spalten. Die DNA wird dann später an eine Säule gebunden und nach Wasch-Schritten eluliert man die genomische DNA wieder.

Wenn man sowas mit Gewebeproben und sogar Wurst machen kann, sehe ich keinen Grund, so ein Kit nicht auch mal mit Käse zu testen...

Gruß,
Zara

[Vektor 23]

Das ist die einfachste Alternative.
Das kenn ich auch, aber uns steht dieses Kit nicht zur Verfügung.
Sonst bräuchte ich mir darüber keine Gedanken machen,wenn ich das Kit bekommen könnte

[zarathustra]

Was soll denn danach mit der DNA überhaupt gemacht werden?
Die Frage geht damit einher, welche Mengen DNA Du rausbekommen willst und wie sauber diese sein muss...

Wenn weder die klassische Phenol/Chloroform-Methode, noch die heute in Kits verwendeten Säulen eingesetzt werden sollen/können, wird es schwierig. Vielleicht zurück zur Glasmilch?
http://bishoplab.bsd.uchicago.edu/protocols/GlassMilk.pdf

Gruß,
Zara

[Vektor 23]

Ich will sie so weit bekommen dass ich eine PCR anfertigen kann.