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Organische Chemie Fragen und Antworten zur Chemie der Kohlenwasserstoffe. Hier kann alles von funktionellen Gruppen über Reaktionsmechanismen zu Synthesevorschriften, vom Methan zum komplexen Makromolekül diskutiert werden.

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Alt 03.09.2019, 17:38   #1   Druckbare Version zeigen
PaddyTime Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 121
Konjugation von Antikörper mit Enzym

Hallo,

ich habe mal wieder ein leidiges Thema, dass eigentlich recht interessant ist.

Ich möchte an einen Antikörper PolyHRP (Poly-Meerrettichperoxidase) konjugieren. Dafür gibt es unzählige Strategien. Nehmen wir mal einen der bekanntesten Fälle als Linker: Glutardialdehyd. Dieses reagiert unselektiv mit den Aminogruppen des Antikörpers und der PolyHRP, wodurch diese vernetzt werden.

Anhand dieses Beispiels habe ich ein paar Fragen:

1. Was sind gewöhnliche Ausgangskonzentrationen der Bioreagenzien (AK und HRP) für eine solche Konjugation?
Die Substanzen sind recht teuer, sodass ich nicht unbegrenzt viel einsetzen kann und möchte. Wie groß sollte im Allgemeinen der Reaktionsansatz sein? Ist ein 0,5 mg Antikörper-Ansatz zu klein gewählt (bei sagen wir 500 µl Reaktionsvolumen), weil sich die Reaktionspartner nicht "finden"? Als stöchiometrisches Verhältnis habe ich bisher immer einen leichten Überschuss der PolyHRP gewählt.

2. Wie sollte man bei der Reaktion am besten vorgehen?
Eigentlich wäre es ja sinnvoll Antikörper und HRP vorzulegen und dann Glutardialdehy hinzuzugeben, oder?

3. Sollte man die Reaktion lieber kürzer (1 h bei 20 °C) oder länger (4 h bei 5 °C) ablaufen lassen?
Habt ihr Erfahrungen unter welchen Bedingungen der Antikörper & das entstehenden Konjugat stabiler sind/sein könnten? Ich denke bei 4 °C, weil dadurch Zersetzungreaktionen ebenfalls zurückgedrängt wird.

Hintergrund dieser Fragen ist, dass ich unter anderem diese Reaktion durchgeführt habe und die Ergebnisse mehr schlecht als recht sind (ELISA). Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erfolgte erst durch Zentrifugieren (die gesamte Reaktion führe ich in einem Filterspin durch) und anschließend eine Aufreinigung mittels Größenausschlusschromatographie. Da sehe ich nur sehr schwache Peaks (wahrscheinlich wegen zu geringer Ausgangskonzentrationen?!).Ich habe allerdings auch das Gefühl, dass mein Antikörper-PolyHRP-Konjugat oder zumindest die PolyHRP an der Membran des Filterspins adsorbiert und ich diese nicht mehr desorbiert kriege. Hat da jemand einen Tipp?


Ich komme bei dem Thema derzeit auf keinen grünen Zweig, um den Antikörper mit dem PolyHRP-Konjugat zu konjugieren. Ich bin für jegliche Antworten auf meine Fragen dankbar und freue mich auch über weitere Hinweise.

LG Paddy


P.S. ich möchte in naher Zukunft einen Amin-Thiol-heterobifunktionen Crosslinker bestellen, und damit im ersten Step die PolyHRP mit dem Linker modifizieren und anschließend mit einem reduzierten Antikörper (Thiolgruppen) reagieren lassen. Ich scheue mich etwas davor sulfo-SMCC zu verwenden, da die Spacerstruktur nicht sehr lang ist und damit evt. sterische Hinderungen zwischen PolyHRP und Antikörper auftreten können. Ist die Sorge berechtigt oder sollte das prinzipiell funktonieren?
PaddyTime ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 04.09.2019, 05:46   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.139
AW: Konjugation von Antikörper mit Enzym

Die Konzentrationen passen überschlagsweise, die eingesetzten Mengen sind relativ gering, sodaß relativ hohe Verluste auftrten. Membranen (wozu soll der Filterspin gut sein?) und SEC-Säulchen gegen unspezifische Bindung mit 1mg/mL BSA in 0.5g/L Tween20 in PBS o.ä. absättigen (5mL reichen für eine PD10). Wenn ich mit PD10 aufreinige, nehme ich wenigstens 5mg Antikörper. Das Problem bei einem homobifunktionellen Crosslinker (Glutaraldehyd) ist, daß Du Alles mit Allem verlinkst und relativ große Aggregate bekommen wirst. Da Antikörper glykosyliert sind, bietet sich Aktivierung mit Periodat an. Für Protokolle siehe "Harlow and Lane, Using Antibodies" (sowas wie die Bibel auf diesem Gebiet). 4grad würde ich vorziehen, da aktive Proteine involviert sind.

Wg. Ausbeute: Hast Du anschließend reduziert (Cyanoborhydrid?). Natriumazid, welches man gerne als Konservierungsmittel zusetzt, zerstört die HRP-Aktivität. EDTA ist auch ungünstig, da es das Eisen aus der HRP klaut. Tris u.ä. haben in den Kopplungspuffern auch nix zu suchen, da Amine mit Aldehyden reagieren.

Lohnt es sich denn, selbst zu konjugieren, anstelle den "üblichen" Weg zu beschreiten und ein kommerzielles sekundäres Konjugat zu verwenden?

Das mit den thiolreaktiven Linkern ist mE risky bei diesen kleinen Mengen. Du mußt das Reduktionsmittel abtrennen (SEC, -> Verluste), bevor Du koppelst und dann stört Luftsauerstoff. Außerdem ist wahrscheinlich, daß Dein Antikörper nachher kaputt ist, da Du die Ketten ja trennst durch die Reduktion. Wenn unbedingt, dann mit großen Mengen (mehrere Milligramm AK) und nur nach sorgfältiger Optimierung und QC/Charakterisierung. Rechne mit Problemen bei der Reproduzierbarkeit.
Wegen sterischer Probleme würde ich mir nicht so den Kopf machen, führe Dir mal den Katalog von Pierce/Thermo zu Gemüte auf der Suche nach Alternativen.
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.

Geändert von imalipusram (04.09.2019 um 06:09 Uhr)
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 04.09.2019, 07:11   #3   Druckbare Version zeigen
PaddyTime Männlich
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Themenersteller
Beiträge: 121
AW: Konjugation von Antikörper mit Enzym

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Die Konzentrationen passen überschlagsweise, die eingesetzten Mengen sind relativ gering, sodaß relativ hohe Verluste auftrten. Membranen (wozu soll der Filterspin gut sein?) und SEC-Säulchen gegen unspezifische Bindung mit 1mg/mL BSA in 0.5g/L Tween20 in PBS o.ä. absättigen (5mL reichen für eine PD10). Wenn ich mit PD10 aufreinige, nehme ich wenigstens 5mg Antikörper. Das Problem bei einem homobifunktionellen Crosslinker (Glutaraldehyd) ist, daß Du Alles mit Allem verlinkst und relativ große Aggregate bekommen wirst. Da Antikörper glykosyliert sind, bietet sich Aktivierung mit Periodat an. Für Protokolle siehe "Harlow and Lane, Using Antibodies" (sowas wie die Bibel auf diesem Gebiet). 4grad würde ich vorziehen, da aktive Proteine involviert sind.

Wg. Ausbeute: Hast Du anschließend reduziert (Cyanoborhydrid?). Natriumazid, welches man gerne als Konservierungsmittel zusetzt, zerstört die HRP-Aktivität. EDTA ist auch ungünstig, da es das Eisen aus der HRP klaut. Tris u.ä. haben in den Kopplungspuffern auch nix zu suchen, da Amine mit Aldehyden reagieren.

Lohnt es sich denn, selbst zu konjugieren, anstelle den "üblichen" Weg zu beschreiten und ein kommerzielles sekundäres Konjugat zu verwenden?

Das mit den thiolreaktiven Linkern ist mE risky bei diesen kleinen Mengen. Du mußt das Reduktionsmittel abtrennen (SEC, -> Verluste), bevor Du koppelst und dann stört Luftsauerstoff. Außerdem ist wahrscheinlich, daß Dein Antikörper nachher kaputt ist, da Du die Ketten ja trennst durch die Reduktion. Wenn unbedingt, dann mit großen Mengen (mehrere Milligramm AK) und nur nach sorgfältiger Optimierung und QC/Charakterisierung. Rechne mit Problemen bei der Reproduzierbarkeit.
Wegen sterischer Probleme würde ich mir nicht so den Kopf machen, führe Dir mal den Katalog von Pierce/Thermo zu Gemüte auf der Suche nach Alternativen.


Vielen Dank für die informative Antwort!
Ich habe den Filterspin genommen, um den Antikörper umzupuffern (ok das geht auch mit der PD10) und um später den überschüssigen Linker aus dem Reaktionsgemisch zu beseitigen (oder sollte ich dazu auch die PD10 nehmen? Wenn ich die PD10-Säule in PBS äqualibriere, stört es dann nicht, wenn mein Reaktionsgemisch in einem anderen Puffer (z. B. CBB) vorliegt und ich das über die Säule schicke? Die Eluate nach der PD10 Aufreinigung müssen im Anschluss ja immer über ein Vivaspin aufkonzentriert werden (das wollte ich mit den Filterspins ebenfalls umgehen).

Natriumazid hab ich nicht zugesetzt. Die Reduktion hab ich mit NaBH3CN gemacht, ja. Ist die Wirkung von EDTA tatsächlich so dramatisch bei Verwendung von HRP? Für die Lagerung kann ichs nachvollziehen, aber auch während einer Kopplungsreaktion?

Okay, ich werde die vorgeschlagene Bibel mal studieren

Aber in Summe scheint es tatsächlich die Ansatzgröße zu sein, die mir die schlechten Ergebnisse bringt. Ich schau in wie fern ich die Einsatzmengen erhöhen kann.

Kommerzielles Konjugat ist vorerst keine Option.
PaddyTime ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 04.09.2019, 07:29   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.139
AW: Konjugation von Antikörper mit Enzym

Zitat:
Zitat von PaddyTime Beitrag anzeigen
ch habe den Filterspin genommen, um den Antikörper umzupuffern (ok das geht auch mit der PD10) und um später den überschüssigen Linker aus dem Reaktionsgemisch zu beseitigen (oder sollte ich dazu auch die PD10 nehmen?
Wichtig ist mE, die beteiligten Oberflächen gegen unspezfische Bindung abzusättigen, so kleine Volumina wie möglich zu verwenden (zB NAP5 statt PD10, von Merck/Millipore gibts auch noch kleinere Säulchen) und so konzentriert wie möglich zu arbeiten, verdünnen kann man immer. Für ein optimales Konjugationsverhältnis von HRP zu AK spielen jedoch viele Parameter eine Rolle: Konzentration, Verhältnis der "Monomeren", Konz. und Art des Crosslinkers, Reaktionszeit, Temperatur, Viskosität der Lösung, pH, Salze. Shortly: It's a nightmare.

Was ich an Zentrifugationskonzentratoren nicht mag, ist, daß man immer nur verdünnt -> tatsächliche Konzentrationen durchrechnen. Für eine vollständige Umsalzung eignen sich mE Säulchen besser: Wenn man zB PD10 mit nur 1ml Probe belädt und dann mit einem 1.5ml "Spacer" aus Elutionspuffer weiterarbeitet, bekommt man praktisch eine Basislinientrennung.

Zitat:
Zitat von PaddyTime Beitrag anzeigen
Kommerzielles Konjugat ist vorerst keine Option.
Zur Klarheit: Ich meinte den sekundären AK (also zB goat-anti-Rabbit-IgG-HRP conjugate). Wenn Du nicht an einem eigenen kommerziellen Test arbeitest, bei dem ein Arbeitsschritt eingespart werden soll, macht die HRP-Konjugation eines primären AK mE keinen Sinn, da aufwändig, verlustreich und Du idR auch noch Empfindlichkeit einbüßt (und im schlimmsten Fall die CDRs maskierst, falls da Lysine drinnen oder in der Nähe sein sollten). Glutaraldehyd alleine kann Dir in diesem Fall die CDRs ruinieren.
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Geändert von imalipusram (04.09.2019 um 07:53 Uhr)
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Alt 05.09.2019, 07:27   #5   Druckbare Version zeigen
PaddyTime Männlich
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Themenersteller
Beiträge: 121
AW: Konjugation von Antikörper mit Enzym

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Wichtig ist mE, die beteiligten Oberflächen gegen unspezfische Bindung abzusättigen, so kleine Volumina wie möglich zu verwenden (zB NAP5 statt PD10, von Merck/Millipore gibts auch noch kleinere Säulchen) und so konzentriert wie möglich zu arbeiten, verdünnen kann man immer. Für ein optimales Konjugationsverhältnis von HRP zu AK spielen jedoch viele Parameter eine Rolle: Konzentration, Verhältnis der "Monomeren", Konz. und Art des Crosslinkers, Reaktionszeit, Temperatur, Viskosität der Lösung, pH, Salze. Shortly: It's a nightmare.

Was ich an Zentrifugationskonzentratoren nicht mag, ist, daß man immer nur verdünnt -> tatsächliche Konzentrationen durchrechnen. Für eine vollständige Umsalzung eignen sich mE Säulchen besser: Wenn man zB PD10 mit nur 1ml Probe belädt und dann mit einem 1.5ml "Spacer" aus Elutionspuffer weiterarbeitet, bekommt man praktisch eine Basislinientrennung.
Den Alptraum kriege ich auch zu spüren. Ich denke tatsächlich das mein Problem die geringen Mengen sind. In der der SEC sehe ich immerhin Konjugationserfolge. Im ELISA dagegen nur schwach (wegen zu größer Verdünnung oder weil der AK kaputt gegangen ist). Ich habe gestern nochmal die Methode mit Natriumperiodat probiert (größerer Ansatz). Mal schauen was die Ergebnisse heute bzw. morgen so zeigen. Es gibt auch Protokolle, da wurde die HRP mit Natriumperiodat umgesetzt und danach der AK zugegeben. Das habe ich noch nicht wieder versucht, evt. rückt das auch noch in den Vordergrund.

Ich habe bei uns im Labor MicroSpin SEC400 "Säulchen" gefunden. Evt. eignen die sich auch zum umpuffern, obwohl da in der Anleitung nichts davon steht wann man den neuen Puffer dazugibt. Ich muss mich da nochmal schlau machen. Genauso auch mit den NAP5 Säulen.




Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Zur Klarheit: Ich meinte den sekundären AK (also zB goat-anti-Rabbit-IgG-HRP conjugate). Wenn Du nicht an einem eigenen kommerziellen Test arbeitest, bei dem ein Arbeitsschritt eingespart werden soll, macht die HRP-Konjugation eines primären AK mE keinen Sinn, da aufwändig, verlustreich und Du idR auch noch Empfindlichkeit einbüßt (und im schlimmsten Fall die CDRs maskierst, falls da Lysine drinnen oder in der Nähe sein sollten). Glutaraldehyd alleine kann Dir in diesem Fall die CDRs ruinieren.
Achso meintest du das. Unsere Idee ist durch Konjugation des primären AKs auf einen zusätzlichen Inkubationsschritt im Assay zu sparen, deswegen wäre das nicht sehr zielführend. In punkto Empfindlichkeit wirst du wahrscheinlich recht haben, aber ich soll es "selber herausfinden", dass dem so ist.
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antikörper, hrp, konjugation

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