Analytik: Instrumentelle Verfahren
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Analytik: Instrumentelle Verfahren Funktion und Anwendung von GC, HPLC, MS, NMR, IR, UV/VIS, etc.

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Alt 05.08.2019, 08:33   #1   Druckbare Version zeigen
BabaGhanuj  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 10
Reinigung HPLC Enzyme

Hallo liebe Forengemeinde,


der Druck meiner HPLC steigt regelmässig aufgrund von Proteinanteilen in den Proben an. Nun zu meiner Frage gibt es eine möglichkeit meine HPLC säulen regelmässig zu Spülen und die festgesetzten Enzymeanteile auszuspülen. Es werden eine Eurokat pb und h säulen von Knauer mit einer Vorsäule verwendet.


Viele Dank im vorraus,


BabaGhanuj
BabaGhanuj ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.08.2019, 09:00   #2   Druckbare Version zeigen
Lucas76 Männlich
Mitglied
Beiträge: 759
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Hallo

Bestimmst du demnach keine Proteine mittels SEC?
Welche Säulen-Dimensionen verwendest du?

Abgesehen davon kannst du, wenn du eine Vorsäule verwendest, natürlich die regelmässig wechseln; was m.M. nach die beste Option wäre.

Die 2. Möglichkeit ist, die Säule gegenzuspülen.
1) Säule verkehrt installieren
2) Verbindung zum Detektor entfehrnen und in Drain/Abfallbehälter
3) Flow mit 10% des üblichen Flusses starten und sukzessive steigern (um bei älteren Säulen, die eventuell komprimiert und einen minimen Holraum ausgebildet haben, einen Riss im Säulenbett zu verhindern.
4) Ich würde anfangs mit dem gewohnten Eluenten starten (bei Gradienten Startbedingungen und auf 50/50 steigern)
jeh nach säulenart kann auch mit anderen Eluenten gereinigt werden (Detergentien bis verd. HNO3; da gibt es viele Tricks)

Viel Erfolg!
Lucas76 ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.08.2019, 09:05   #3   Druckbare Version zeigen
Lucas76 Männlich
Mitglied
Beiträge: 759
AW: Reinigung HPLC Enzyme

ich sehe gerade, die Säule, die du verwendest (Divinyl/Styrene-Copolymer, 6% vernetzt sulfoniert), würde höchst wahrscheinlich auch stark verdünnte Salpetersäure erleiden...das würde ich trotzdem nur im Notfall ausprobieren.
Lucas76 ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 05.08.2019, 09:28   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Zitat:
Zitat von Lucas76 Beitrag anzeigen
ich sehe gerade, die Säule, die du verwendest (Divinyl/Styrene-Copolymer, 6% vernetzt sulfoniert), würde höchst wahrscheinlich auch stark verdünnte Salpetersäure erleiden...das würde ich trotzdem nur im Notfall ausprobieren.
Im IFU der Säule sollte doch eigentlich drinstehen, wie man sie weider suaber bekommt. Statt die Säule alle Naselang manuell umzudrehen und dann wieder zurück, könnte es sinnvoll sein, die Säule an ein doppeltes Umschaltventil zu hängen und den Prozess zu automatisieren.
Hält das Meterial verdünnte Natronlauge aus (wird gerne bei Sepharosen verwendet, die sollten empfindlicher sein, als Polystyrol?
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.08.2019, 12:04   #5   Druckbare Version zeigen
Lucas76 Männlich
Mitglied
Beiträge: 759
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Kenne die Säule zu wenig (sind alle Sulfongruppen endcapped?; etc.)
Desshalb würde ich nach NaOH spülen sicher noch mit einer Säule nachspülen, um die Sulfongruppen, die frei sind wierder in die H-Form zu bringen.
Wäre möglich dass diese Säule eine Multimode-Säule ist und auch über Ionenaustausch trennt.

Deine Frage habe ich aber trotzdem nicht ganz verstanden.
Lucas76 ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.08.2019, 17:04   #6   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.697
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Das sind beides Kationenaustauscher-Säulen.

Da man Ionenaustauscher gerne für die Aufreinigung von Proteinen verwendet, gibt es auch einige Protokolle, wie man entsprechende Säulen wieder sauber bekommt:
Man kann bspw. mit 2 M NaCl waschen, dann 1 M NaOH und anschließend wieder mit 2 M NaCl auswaschen, anschließend wieder Wasser.
Im schlimmeren Fall kann man mit 6 M Guanidiniumchlorid waschen oder die Säule mit saurer Lösung vorbereiten und dann Pepsin-Lösung drüber laufen lassen, um die Proteine zu spalten.

Grüße,
Zara
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 09.08.2019, 11:08   #7   Druckbare Version zeigen
BabaGhanuj  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 10
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Hallo,



erst mal vielen Dank für die zahlreichen Antworten und entschuldigt bitte meine späte Reaktion aufgrund von anderen Verpflichtungen.
Erst einmal möchte ich noch genauer auf mein Problem eingehen. Insgesamt befinden sich zwei Hauptsäulen (Eurokat Pb und Na) und eine Vorsäule (Eurokat Na). Entschuldigt bitte die teilweise Falschangabe im ersten Post. Mit diesem System werden Hemicellulosen und deren Hydrolyse Produkte sowie Zuckeralkohole analysiert.
Das Ganze hat bis vor geraumer Zeit geklappt. Seid jedoch ein neues Enzym verwendet wird, kommt es regelmäßig zum Anstieg des Drucks in der Anlage. Bisher erfolgte dann immer eine Spülung der einzelnen Säulen gegen die Flussrichtung und anschließend eine Regeneration, wie sie Kanuer vorschlägt.
Danach fällt der Druck wieder, jedoch nimmt das ganze viel Zeit in anspruch und die Anlage muss danach wieder neu kalibriert werden (?). Daher ist mein Anliegen eine einfache Lösung zu finden, sollte diese existieren, um die Proteinbestandteile aus der Säule zu spülen.
Die Proben werden in einem Wasserbad behandelt bis die enthaltenen Enzyme flockig ausfallen anschließend werden diese in einer Zentrifuge abgetrennt und die Flüssigphase wird verdünnt, um danach noch einmal gefiltert zu werden.



-Hat vlt. jemand eine Idee bezüglich der Probenvorbereitung?



-Gehe ich richtig in der Annahme das alle drei Säulen einzeln gegen den Strom gespült werden müssen? -> Die Idee mit dem Umschaltventil gefällt mir sehr gut, aber das Problem stellt die Reihenschaltung der Säulen dar?!



Vielen Dank für Eure Vorschläge!



Viele Grüße
BabaGhanuj
BabaGhanuj ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 09.08.2019, 11:51   #8   Druckbare Version zeigen
Lucas76 Männlich
Mitglied
Beiträge: 759
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Du arbeitest ja mit einer Vorsäule, da könntest du eigentlich nur diese rückspülen.
Da kannst du dann auch etwas "rücksichtsloser" vorgehen, bezüglich Fluss vorsichtig erhöhen.

Da die Enzyme wahrscheinlich nicht die Vorsäule passieren. Wenn du aber bei der ProVor über 0.2µm oder 0.45µm Spritzenfilter filtrierst (was ich schwer annehme), könnte es theoretisch auch sein, dass gewisse unvollständig abgebauten Bestandteile doch durch die Säule rauschen, aber nach der Runtime nicht vollständig von der Säule eluiert wurden und beim Gradientenanstieg irgendwo in der Säule ausfallen....das halte ich aber für unwahrscheinlich.

Versuch mach kluch....einfach mal nur die Vorsäule gegenspülen und danach schauen, ob der Druck wieder die gewohnte Grösse aufweist.

Viel Erfolg!
Lucas76 ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 09.08.2019, 12:19   #9   Druckbare Version zeigen
BabaGhanuj  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 10
AW: Reinigung HPLC Enzyme

Hallo Lucas,


vielen Dank für deine Antwort. Du bist goldrichtig mit der Annahme das ich Spritzenvorsatzfilter verwende (0,2 µm). Ich werde deinen Rat beherzigen und am Montag einfach nur die Vorsäule Spülen.

Was ich vergessen habe, zwischen den einzelenen Runs werden Spüldurchgänge von jeweils 60 min gefahren. Der Volumenstrom beträgt für Spülen und Analyse jeweils 0,5 ml/min.


Viele Grüße und Danke!
BabaGhanuj ist offline   Mit Zitat antworten
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