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Alt 22.05.2018, 20:57   #1   Druckbare Version zeigen
Peter Schulz  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 264
Frage zu ELISA

Ich habe hier zu ELISA folgendes Protokoll:


1. Beschichten der Mikrotiterplatte mit Antigen
2. Blockieren mit Milchpulver
3. Inkubieren mit 1. Antikörper
4. Waschen
5. Inkubieren mit 2. Antikörper
6. Waschen
7. Entwickeln (Zugabe Subtrat -> Färbung)


Der 2. Antikörper ist mit dem Enzym konjugiert und bindet quasi an den 1. Antikörper. Meine Frage ist jetzt, warum man nicht einfach den 1. Antikörper, der an das Antigen bindet, mit dem Enzym konjugieren und sich quasi den zweiten Antikörper sparen kann?
Peter Schulz ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 22.05.2018, 23:43   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.592
AW: Frage zu ELISA

Zu welchem Zweck dient der ELISA bei deinem Beispiel denn bzw. was soll nachgewiesen werden?

Das Verfahren passt ja zum Nachweis eines Antikörpers, um bspw. einen Antikörper-Titer nachzuweisen. In dem Fall immobilisierst du das spezifische Antigen, gibst bspw. ein Patientenserum zu (erster Antikörper aus dem Patientenmaterial bindet) und kannst die Antikörper dann mit dem zweiten Antikörper nachweisen.

Ansonsten verwendet man solche indirekten Verfahren mit Primär- und markiertem Sekundärantikörper auch gerne, weil man empfindlicher wird - mehrere Sekundärantikörper binden einen Primärantikörper, so dass das Signal verstärkt wird. Außerdem kann man mehrere Assays parallel aufbauen mit unterschiedlichen Primärantikörpern und kauft nur ein paar teure, markierte Sekundärantikörper. Das ist oft sinnvoller, als sich viele verschiedene, teuer markierter Primärantikörper zuzulegen.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 23.05.2018, 02:52   #3   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.256
AW: Frage zu ELISA

Zitat:
Zitat von Peter Schulz Beitrag anzeigen
Der 2. Antikörper ist mit dem Enzym konjugiert und bindet quasi an den 1. Antikörper.
Nein. Dazwischen bindet der Analyt. Der kann zwar auch ein Antiküörper sein (zB bei der Bestimmung des Titers von Antikörpern gegen HBV-Viren im Serum bei der Überprüfung des HBV-Impfstatus), zum besseren Verständnis stell Dir erst mal vor, es sei irgendein Protein, zB Botulinumtoxin. Der 2. Antikörper (mit zB Peroxidase markiert) bindet nur, wenn der Analyt an den ersten (auf der Platte immobilisierten) AK gebunden hat. So ist das Signal, das Du in der Farbreaktion bekommst, proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe.

Siehe auch "Sandwich ELISA" im Netz.
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I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 23.05.2018, 11:25   #4   Druckbare Version zeigen
Caliban Männlich
Mitglied
Beiträge: 607
AW: Frage zu ELISA

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Nein. Dazwischen bindet der Analyt. Der kann zwar auch ein Antiküörper sein (zB bei der Bestimmung des Titers von Antikörpern gegen HBV-Viren im Serum bei der Überprüfung des HBV-Impfstatus), zum besseren Verständnis stell Dir erst mal vor, es sei irgendein Protein, zB Botulinumtoxin. Der 2. Antikörper (mit zB Peroxidase markiert) bindet nur, wenn der Analyt an den ersten (auf der Platte immobilisierten) AK gebunden hat. So ist das Signal, das Du in der Farbreaktion bekommst, proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe.

Siehe auch "Sandwich ELISA" im Netz.
Nein. Bzw. nicht zwangsweise. Auch die ELISA-Variante wie oben beschrieben existiert. Nicht alle ELISAs sind Sandwich-ELISAs...

Ansonsten hat zarathustra den Hintergrund schon gut beschrieben. Gerade auch der Kostenaspekt spielt wirklich eine große Rolle. Gelabelte Antikörper sind teuer und so benötigt man eben nur wenige sekundäre gelabelte Antikörper anstatt für jedes einzelne Antigen einen Antikörper kaufen zu müssen.
Caliban ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 23.05.2018, 14:19   #5   Druckbare Version zeigen
Peter Schulz  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 264
AW: Frage zu ELISA

Zitat:
Zitat von zarathustra Beitrag anzeigen
Zu welchem Zweck dient der ELISA bei deinem Beispiel denn bzw. was soll nachgewiesen werden?
IgA- und IgG-Antikörper im Serum...



Zitat:

Das Verfahren passt ja zum Nachweis eines Antikörpers, um bspw. einen Antikörper-Titer nachzuweisen. In dem Fall immobilisierst du das spezifische Antigen, gibst bspw. ein Patientenserum zu (erster Antikörper aus dem Patientenmaterial bindet) und kannst die Antikörper dann mit dem zweiten Antikörper nachweisen.
Danke.. Stimmt, die Antikörper im Serum können ja nicht mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert sein. Darauf hätte man kommen können.

@imalipusram: Caliban hat Recht; es handelt sich nicht um Sandwich-ELISA.
Peter Schulz ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 23.05.2018, 17:44   #6   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.256
AW: Frage zu ELISA

Zitat:
Zitat von Peter Schulz Beitrag anzeigen
@imalipusram: Caliban hat Recht; es handelt sich nicht um Sandwich-ELISA.
Habs gerade gesehen, Du coatest das Antigen. Ist nicht Stand der Technik, die Well zu Well-Variation bei gleicher Konzentration des Analyten dürfte idR ziemlich groß sein, aufgrund von Inhomogenitäten der Oberfläche von Kavität zu Kavität. Wird kommerziell idR deshalb nicht angewendet, auch wenns Geld spart. Qualiative Aussagen kann man damit natürlich treffen.
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Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
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