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Alt 30.05.2018, 18:55   #1   Druckbare Version zeigen
stefx Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 80
Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Hallo zusammen

Ich habe eine ganz allgemeine und Frage.

Was ist ein gutes Vorgehen um herauszufinden welche Proteine an ein Antibiotika binden?

Ich habe an einen Proteom Chip gedacht wo verschiedene Proteine immobilisiert sind. Danach würde man das biotinylierte Antibiotika dazugeben und danach zum Beispiel Cy3-Streptavidin. ==> Signal

Ist das zu kompliziert? Gibt es einfachere Methoden?

Danke
stefx ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 30.05.2018, 19:46   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.622
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Das hört sich extrem aufwändig an. Wenn es das biotinylierte Antibiotikum gibt, könntest du es auch einfach auch Strep-Beads geben, waschen und mit Zell-Lysat bzw. Bakterienlysat inkubieren. Anschließend waschen, die Proteine von den Beads kochen, SDS-PAGE machen und die Banden in die Massenspektrometrie geben.

Passende Kontrollen solltest du natürlich nicht vergessen...

Grüße,
Zara
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 30.05.2018, 22:33   #3   Druckbare Version zeigen
FK Männlich
Moderator
Beiträge: 61.270
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Wie soll das Antibiotikum mit Biotin verknüpft sein?
Da Biotin eine Carbonsäure ist, ginge das nur über einen Ester oder evtl. über ein Amid. Dazu müsste das Antibiotikum eine Amino- oder Hydroxygruppe besitzen. Womit dann schon 2 Gruppen, die über H-Brücken an Proteine anbinden könnten, weg sind.

Und wer sagt Dir dann, WOMIT so ein modifizierte Antibiotikum am Protein andockt?
Ist es der Biotinrest, oder der restliche Teil des Antibiotikums?

Um welches Antibiotikum geht es überhaupt?

Gruß,
Franz
__________________
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Alt 31.05.2018, 05:30   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.578
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Zitat:
Zitat von FK Beitrag anzeigen
Wie soll das Antibiotikum mit Biotin verknüpft sein? Da Biotin eine Carbonsäure ist, ginge das nur über einen Ester oder evtl. über ein Amid. Dazu müsste das Antibiotikum eine Amino- oder Hydroxygruppe besitzen. Womit dann schon 2 Gruppen, die über H-Brücken an Proteine anbinden könnten, weg sind. Und wer sagt Dir dann, WOMIT so ein modifizierte Antibiotikum am Protein andockt? Ist es der Biotinrest, oder der restliche Teil des Antibiotikums?
Man würde deshalb wohl eher label free vorgehen wollen: zB mittels Surface Plasmon Resonance (SPR) mit immobilisiertem Protein, Circulardichroismus-Spektroskopie (CD), alles Methoden, bei denen man die Änderung physikochemischer Parameter bei Bindung ausnützt. Sollte das Antibiotikum farbig sein, kann man es auch zu einem Extrakt geben, eine Proteintrennung unter nicht zu harschen Bedingungen durchführen und gucken, welche Proteine bunt geworden sind.

Die Methoden sollten aber skalierbar und automatisierbar sein und die Proteine verfügbar, sonst forscht man sich einen Wolf.

Wenn es darum gehen sollte, unbekannte Proteine in zB einem Bakterium zu isolieren und dann zu identifizieren, würde ich dennoch Affinitätschromatographie probieren: Antibiotikum immobilisieren und dann hoffen, daß was an der Säule hängen bleibt und das auch noch spezifisch, das Eluat dann per 2D-PAGE auftrennen und die Spots nach einem tryptischen Verdau per MS und Datenbankabgleich identifizieren. Evtl. verschiedene Strategien zur Immobilierung des Antibiotikums probieren, wenn es nicht auf Anhieb klappen sollte.

Wenn die Proteine bekannt und Strukturdaten vorhanden sind, kann man den Spaß auch im Trockenen probieren: Docking heißt das Zauberwort. Experimentell bestätigen natürlich nicht vergessen.
__________________
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Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.

Geändert von imalipusram (31.05.2018 um 05:36 Uhr)
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 31.05.2018, 10:00   #5   Druckbare Version zeigen
chemiewolf Männlich
Mitglied
Beiträge: 21.760
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Zitat:
Zitat von FK Beitrag anzeigen
Wie soll das Antibiotikum mit Biotin verknüpft sein? Da Biotin eine Carbonsäure ist, ginge das nur über einen Ester oder evtl. über ein Amid. Dazu müsste das Antibiotikum eine Amino- oder Hydroxygruppe besitzen. Womit dann schon 2 Gruppen, die über H-Brücken an Proteine anbinden könnten, weg sind. Und wer sagt Dir dann, WOMIT so ein modifizierte Antibiotikum am Protein andockt? Ist es der Biotinrest, oder der restliche Teil des Antibiotikums?
deswegen wird die Biotinylierung auch kaum bei kleinen Molekülen angewandt, sondern normalerweise bei Proteinen oder DNA. Hier spielt die Modifikation keine oder kaum eine Rolle.
__________________
The State Senate of Illinois yesterday abandoned its Committee on Efficiency and Economy for reasons of 'efficiency and economy'.
De Moines Tribune, 6 February 1955
einfach mal eine Fanta trinken
chemiewolf ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 01.06.2018, 21:20   #6   Druckbare Version zeigen
stefx Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 80
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Danke für eure Hilfe und die zahlreichen Inputs!

Welches Antibiotikum kann ich euch nicht sagen. Es ist nur eine hypothetische Fragestellung.

Zum Versuch mit der Affinitätschromatographie. Meint ihr auch so etwas wie eine TAP (tandem affinity purification) ist möglich?

Das bedeutet:

mögliche Bindugsproteine---Antibiotikum----Spacer---CBP---TEV site-Protein A--Säule

Anschliessend würde eine MS folgen und die Proteine zu identifizieren.
stefx ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 01.06.2018, 22:08   #7   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.622
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Zitat:
Zitat von stefx Beitrag anzeigen
Zum Versuch mit der Affinitätschromatographie. Meint ihr auch so etwas wie eine TAP (tandem affinity purification) ist möglich?

Das bedeutet:

mögliche Bindugsproteine---Antibiotikum----Spacer---CBP---TEV site-Protein A--Säule
TAP-Tag-Assays verwendet man für Proteine, um andere Proteine zu identifizieren, die daran binden. Dabei klonierst du ein Konstrukt, das die kodierende Sequenz für dein Protein und die beiden AFfinitäts-Tags trägt. Anschließend exprimierst du das Konstrukt in den Zielzellen, lysierst sie und "fischst" nach deinem getaggten Protein und seinen Bindungspartnern.

Wie möchtest du du das für ein Antibiotikum machen? (-> Wird nicht klappen!)

Mein Ansatz oben war übrigens, dass du dir ein passendes Antibiotikum mit Spacer und Biotin synthetisieren lässt. Wir haben tatsächlich jemanden, der das mit einem anderen Wirkstoff genau so gemacht hat und nach Bindungspartnern gesucht hat.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 02.06.2018, 09:16   #8   Druckbare Version zeigen
stefx Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 80
AW: Welches Protein bindet an ein Antibiotikum

Vielen Dank für die weiteren Ausführungen!
Der Ansatz mit der Affinitätschromatographie macht also am meisten Sinn =)
stefx ist offline   Mit Zitat antworten
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Stichworte
antibiotika, bindung, protein

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