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Alt 30.03.2019, 17:23   #1   Druckbare Version zeigen
Timmyyy  
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Themenersteller
Beiträge: 4
Multimerisierung von Proteinen durch Frieren?

Hallo Freunde, ich habe eine Frage bezüglich dem Verhalten von Proteinen beim einfrieren: Mir ist klar dass dabei immer einige Proteine dadurch aggregieren und ausfallen können, aber weiß einer von euch zufällig ob beim frieren und auftauen auch kleinere Komplexe in großer Zahl entstehen? Also zum beispiel hexamere oder dimers of trimers?

Ich reinige und analysiere derzeit mehrere Proteine und Proteinkomplexe und habe dafür meine 9 Ansätze über eine Nickel-NTA-Säule gereinigt und anschließend mit 20% Glycerin in Stickstoff eingefroren und anschließend bei -20°C gelagert. Nachdem alle Ansätze gereinigt waren habe ich jetzt die Proteine zur weiteren Reinigung und Analyse auf eine 125ml HiLoad Superose 6 (5kDa - 5000kDa) Säule geladen und aufgetrennt. Bei dem ersten Protein bei dem ich ein Dimer erwartet hätte (2x 110kDa, bisher noch keine Studien zur Quartärstruktur vorhanden) erhalte ich jedoch mehrere peaks, bei denen der größte noch vor meinem 660 kDa Kalibrierungsprotein eluiert. Das SDS-Gel hat bestätigt dass in all den peaks ausschließlich das 110kDa Protein vorliegt. Ich habe das gleiche Protein in früheren Experimenten häufiger eingefroren und anschließend war das Proteine über Monate und nach mehrmaligen wieder auftauen noch enzymatisch aktiv.
Bei dem zweiten Proteine dass ich aufgetrennt habe sehe ich auch mehrere peaks die viel früher als erwartet kommen, das SDS-Gel dazu läuft noch. Hier hätte ich eigentlich ein 130 kDa Monomer erwartet, das Ding ist aber super stark geladen und für die Rekrutierung von allerhand Sachen verantwortlich, hier könnte ich mir vorstellen dass da auch einfach unspezifische Sachen des Expressionsstamms dran kleben, ich melde mich dann nochmal wenn das Gel durch ist.

Hat jemand hier schon mal ähnliche Erfahrungen gemacht? Glaubt ihr die Proteine liegen in vivo auch in solchen Multimeren vor oder ist so was ein gewöhnliches Artefakt durch das Einfrieren oder so was? Als Puffer wurde schon ein high salt buffer mit einer recht hohen ionischen Stärke genommen (300mM NaCl).

Danke schon mal für eure Beiträge!
Tim

Geändert von Timmyyy (30.03.2019 um 17:35 Uhr)
Timmyyy ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 30.03.2019, 19:54   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.667
AW: Multimerisierung von Proteinen durch Frieren?

Hallo Tim,
was du beschreibst ist eigentlich "ganz normal".

Zitat:
Zitat von Timmyyy Beitrag anzeigen
Hallo Freunde, ich habe eine Frage bezüglich dem Verhalten von Proteinen beim einfrieren: Mir ist klar dass dabei immer einige Proteine dadurch aggregieren und ausfallen können, aber weiß einer von euch zufällig ob beim frieren und auftauen auch kleinere Komplexe in großer Zahl entstehen? Also zum beispiel hexamere oder dimers of trimers?
Es können beim Einfrieren und Auftauen auch alle möglichen Oligomere entstehen, aber das hängt natürlich auch vom Protein und den Pufferbedingungen ab.

Zitat:
Zitat von Timmyyy Beitrag anzeigen
Ich reinige und analysiere derzeit mehrere Proteine und Proteinkomplexe und habe dafür meine 9 Ansätze über eine Nickel-NTA-Säule gereinigt und anschließend mit 20% Glycerin in Stickstoff eingefroren und anschließend bei -20°C gelagert. Nachdem alle Ansätze gereinigt waren habe ich jetzt die Proteine zur weiteren Reinigung und Analyse auf eine 125ml HiLoad Superose 6 (5kDa - 5000kDa) Säule geladen und aufgetrennt. Bei dem ersten Protein bei dem ich ein Dimer erwartet hätte (2x 110kDa, bisher noch keine Studien zur Quartärstruktur vorhanden) erhalte ich jedoch mehrere peaks, bei denen der größte noch vor meinem 660 kDa Kalibrierungsprotein eluiert.
Nachdem du eine His-Tag-Aufreinigung gemacht hast, hast du das Imidazol per Dialyse entfernt vor dem Einfrieren? Das ist für einige Proteine wichtig, damit sie nicht kaputt gehen. Alternativ ist es natürlich sinnvoll, auch eine präparative Gelfiltration zu machen, dabei entfernst du nicht nur weitere Verunreinigungen und das Imidazol, sondern siehst auch, ob das Protein als Monomer/Dimer läuft.
Aber warum lagerst du die Protein denn bei -20°C und nicht bei -80°C? Bzw. bei Enzymen kannst du 50% Glycerin nehmen und die Proteine bei -20°C lagern, die Lösung wird dann nicht fest und du hast keine "freeze-thaw"-Zyklen.

Zitat:
Zitat von Timmyyy Beitrag anzeigen
Das SDS-Gel hat bestätigt dass in all den peaks ausschließlich das 110kDa Protein vorliegt. Ich habe das gleiche Protein in früheren Experimenten häufiger eingefroren und anschließend war das Proteine über Monate und nach mehrmaligen wieder auftauen noch enzymatisch aktiv.
Auch wenn sich Oligomere bilden, bedeutet das ja nicht, dass das Protein nicht aktiv sein könnte...

Zitat:
Zitat von Timmyyy Beitrag anzeigen
Bei dem zweiten Proteine dass ich aufgetrennt habe sehe ich auch mehrere peaks die viel früher als erwartet kommen, das SDS-Gel dazu läuft noch. Hier hätte ich eigentlich ein 130 kDa Monomer erwartet, das Ding ist aber super stark geladen und für die Rekrutierung von allerhand Sachen verantwortlich, hier könnte ich mir vorstellen dass da auch einfach unspezifische Sachen des Expressionsstamms dran kleben, ich melde mich dann nochmal wenn das Gel durch ist.
Das wirst du ja am Gel sehen. Ansonsten geben His-Tag-Reinigungen natürlich gerne eine Vielzahl von Verunreinigungen, die an die Ni-NTA-Säulen binden. Da lohnt sich teilweise ein Imidazol-Gradient, um solche Proteine zu entfernen, bevor dein Protein eluiert.

Zitat:
Zitat von Timmyyy Beitrag anzeigen
Glaubt ihr die Proteine liegen in vivo auch in solchen Multimeren vor oder ist so was ein gewöhnliches Artefakt durch das Einfrieren oder so was? Als Puffer wurde schon ein high salt buffer mit einer recht hohen ionischen Stärke genommen (300mM NaCl).
Naja, in einer Zelle kommen Proteine natürlich nicht in so hohen Konzentrationen vor und nicht ohne andere Proteine, die eine Aggregation verhindern können bzw. an die entsprechenden Proteine binden. Außerdem hast du keine Einfrier- und Auftau-Effekte. Insofern würde ich vom Verhalten isolierter, aufkonzentrierter Proteine nicht großartig auf das Verhalten von Proteinen im Inneren einer Zelle schließen wollen...

Grüße,
Zarathustra
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 30.03.2019, 22:28   #3   Druckbare Version zeigen
Timmyyy  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 4
AW: Multimerisierung von Proteinen durch Frieren?

Hi, vielen Dank für deine Antwort!
das war im Prinzip eine Präparative Gelfiltration, ich brauche die einzelnen Proteine und die interagierenden Komplexe dieser für ein anderes Experiment (HDX) und hatte gehofft zusätzlich noch Informationen über die Stöchiometrie rauszubekommen.

Zitat:
Nachdem du eine His-Tag-Aufreinigung gemacht hast, hast du das Imidazol per Dialyse entfernt vor dem Einfrieren? Das ist für einige Proteine wichtig, damit sie nicht kaputt gehen. Alternativ ist es natürlich sinnvoll, auch eine präparative Gelfiltration zu machen, dabei entfernst du nicht nur weitere Verunreinigungen und das Imidazol, sondern siehst auch, ob das Protein als Monomer/Dimer läuft.
Leider habe ich in diesem Fall keine Dialyse gemacht weil bei der anschließenden Gelfiltration ja ohnehin der Puffer ausgetauscht wird wie du bereits gesagt hast. Das könnte in der Tat ein Problem sein! Bei den vorherigen Experimenten zur Aktivität des Proteins hat das Imidazol nicht geschadet (habe beides ausprobiert), deshalb dachte ich ich könnte die Proteine bis zur Gelfiltration mit Imidazol lagern.


Zitat:
Aber warum lagerst du die Protein denn bei -20°C und nicht bei -80°C? Bzw. bei Enzymen kannst du 50% Glycerin nehmen und die Proteine bei -20°C lagern, die Lösung wird dann nicht fest und du hast keine "freeze-thaw"-Zyklen.
Das ist eine super Idee, danke.


Habe bis gerade noch ein paar weitere SDS-Gele gemacht und bei dem zweiten Protein gesehen dass es zwar viel früher eluiert als gedacht, aber glücklicherweise als ein einzelner sharfer peak. In den anderen peaks befindet sich das Protein nicht. Vermutlich läuft es einfach nur sehr weird, es gibt keine Kristallstruktur zu dem Ding aber ich glaube es ist recht ungeordnet.
Ich habe jetzt mal beide Proteine zusammen auf die Säule gegeben. Es wäre eigentlich cool wenn die Interaktion der beiden eine bestimmte Stöchiometrie stabilisieren würde. Ansonsten bleibt mir wohl nichts anderes übrig als nochmal frisches Protein herbeizuschaffen und es direkt nach der NiNTA-Renigung auf der Gefi zu analysieren Habe seit kurzem erst meinen Chef überredet dass wir die Superose-Säule kaufen. Bisher hatten wir nur Superdex (10 - 600 kDa), da waren solche Komplexe immer nur im Void^^' Was mir dazu einfällt: Auf der Superdex lief der Großteil im void, auch als ich das Protein vorher nicht eingefroren hatte. Das würde eigentlich dafür sprechen dass die Multimere keine Artefakte sind sondern ich sie bisher nur nicht sehen konnte. Aber warten wir mal ab! =)

Liebe Grüße, Tim
Timmyyy ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 31.03.2019, 04:54   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 6.959
AW: Multimerisierung von Proteinen durch Frieren?

Zitat:
Zitat von Timmyyy Beitrag anzeigen
Leider habe ich in diesem Fall keine Dialyse gemacht weil bei der anschließenden Gelfiltration ja ohnehin der Puffer ausgetauscht wird wie du bereits gesagt hast.
Wenns schnell gehen soll, geh stattdessen Umsalzen. Du hast idR außerdem weniger Verluste. Sephadex G25, PD-10 Säulchen oder eine Hi-Prep in der FPLC. Dialyseschlauch eignet sich jedoch gut zum Aufkonzentrieren gegen PEG.
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
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