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Alt 17.07.2014, 09:43   #1   Druckbare Version zeigen
Phagenmaus weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 3
Achtung Mindestkonzentration bei ssDNA Fällung

Hallo zusammen,

ich habe mal eine paar technische Fragen an die Runde.

Wir müssen eine Plasmid-ssDNA ausfällen, die bei gut 30 ml Volumen aber nur 5 µg/ml Konzentration aufweist und sind uns nicht sicher, ob wir diese überhaupt ausgefällt bekommen. Müssen wir vorher irgendwie versuchen, das Volumen zu verringern um in einen fällbaren Bereich zu kommen?

Hat irgendwer Erfahrungen damit, so geringe Konzentrationen quantitativ auszufällen?
Und wenn ja, wie macht ihr das?
Nehmt ihr Ethanol oder Isoprop?

Über Hinweise wären wir echt dankbar.
Phagenmaus ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.07.2014, 09:50   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.406
AW: Mindestkonzentration bei ssDNA Fällung

Wenn die Lösung sonst recht sauber ist, würde ich iPropOH nehmen, sonst wirds ne Volumenschlacht (irgendwie müßt Ihr das Zeugs ja bei 15.000g oder so zentrifugieren).

5ug/ml sind eigentlich recht ordentlich, Ihr könnt noch etwas Glycogen vor der Fällung zuegben, dann wirds quantitativer.
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I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
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Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 17.07.2014, 10:15   #3   Druckbare Version zeigen
Phagenmaus weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 3
AW: Mindestkonzentration bei ssDNA Fällung

Danke für den Tipp.
Leider sind 5µg/ml extrem wenig, sollte eigentlich bei 50-60 µg/ml liegen. Deswegen das aufkonzentrieren.

Glycogen können wir leider nicht nehmen als Fällungshilfe. Die muss quantitativ entfernbar sein hinterher durch Waschen o.ä. Davon darf definitiv nichts mehr nachweisbar sein. Es bleiben also nur Salze.
Phagenmaus ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.07.2014, 10:23   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.406
AW: Mindestkonzentration bei ssDNA Fällung

Eventuell klappts mit einem PCR-cleanup- oder einem Miniprep-Kit: Die ganze DNA dem Protokoll entsprechend an das Säulenmaterial binden und dann konzentrierter eluieren. Viel kann eigentlich nicht schiefgehen, denn was nicht bindet, ist im Durchlauf, den man immer noch traditionell fällen kann.
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