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Alt 15.07.2018, 19:22   #1   Druckbare Version zeigen
Kalink weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
DNA Verunreinigung

Hallo,

ich bitte einmal um folgende Analyse:

Ich habe einen Fehler gemacht und für ein Projekt leider eine DNA-Probe genommen, die den Reinheitskriterien nicht entspricht (260/280: 1,61).
Inwieweit ist dieser Fehler von Bedeutung?
Eine Projektwiederholung ist ausgeschlossen
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Alt 16.07.2018, 04:22   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.572
AW: DNA Verunreinigung

Worum gehts denn genau?
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I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 16.07.2018, 07:08   #3   Druckbare Version zeigen
Kalink weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
AW: DNA Verunreinigung

Um eine Proteinexpression...
Kalink ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 16.07.2018, 08:15   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.572
AW: DNA Verunreinigung

Hast Du Protein bekommen?
Schreib mal den ganzen Versuch auf, sonst wirds nur eine Kristallkugelei.
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imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 16.07.2018, 16:20   #5   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.622
AW: DNA Verunreinigung

Erstmal schreibst du doch, dass es eh keine Möglichkeit mehr gibt, etwas zu wiederholen. Insofern ist es doch völlig egal, was wir hier schreiben, du kannst eh nichts mehr ändern.

Wenn ich deine sehr dünnen zwei Infosätze richtig interpretiere, dann hast du ein Plasmid kloniert, das kein tolles A260/A280-Verhältnis hatte, hast dieses in Bakterien transformiert und diese zur Proteinexpression verwendet. Anschließend hast du daraus das Protein gereinigt, nehme ich an.

Sofern das Protein am Ende in Ordnung war, würde ich mir keine Sorgen machen.
Die Absorptionsmessung am Anfang zeigt, dass die DNA nicht ganz rein ist. Anschließend wird diese ja in Bakterien eingebracht und die Zellen selektiert, die das Plasmid ausgenommen haben. Wenn einzelne Zellen durch die Verunreinigungen Probleme bekommen un sterben sollten, so selektionierst du sie sowieso aus.

Ähnlich würde ich die Situation sehen, wenn du das Plasmid zur Transfektion von Säuger-Zellen verwendet hast. Die meisten Zellen wird es nicht interessieren, wenn bspw. noch Proteine in der DNA enthalten waren. Vorsichtig wäre ich nur, wenn du spezielle Zellen wie Immunzellen verwendet hast und diese sich mit der verunreinigten DNA anders verhalten als Zellen, die mit einem sauberen Kontroll-Plasmid transfiziert wurden.

Grüße,
Zara
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 16.07.2018, 17:12   #6   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.572
AW: DNA Verunreinigung

Zitat:
Zitat von zarathustra Beitrag anzeigen
dann hast du ein Plasmid kloniert, das kein tolles A260/A280-Verhältnis hatte
hatte das jemals jemand im real life? Man kann stabile Zellinien auch mit Plasmiden basteln, die man so schnell mal eben mittels alkalischer Lyse und iPropOH-Fällung aus einer Miniprep isoliert hat (A260/A280 so um die 1.1. Haha).
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Geändert von imalipusram (16.07.2018 um 17:39 Uhr)
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 16.07.2018, 23:44   #7   Druckbare Version zeigen
Kalink weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
AW: DNA Verunreinigung

@zarathustra:
Danke für deinen ausführlichen Kommentar
Zum Thema:
Ich habe DNA gekauft, damit eine Maxipep gemacht und die (leider unreine) DNA für eine zellfreie Expression verwendet. Die Proteinsynthese hat jedoch einwandfrei funktioniert...
Kalink ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.07.2018, 18:48   #8   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.622
AW: DNA Verunreinigung

Zitat:
Zitat von Kalink Beitrag anzeigen
@zarathustra:
Danke für deinen ausführlichen Kommentar
Zum Thema:
Ich habe DNA gekauft, damit eine Maxipep gemacht und die (leider unreine) DNA für eine zellfreie Expression verwendet. Die Proteinsynthese hat jedoch einwandfrei funktioniert...
Da es geklappt hat, würde ich mir keine Gedanken mehr machen.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.07.2018, 18:52   #9   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.622
AW: DNA Verunreinigung

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
hatte das jemals jemand im real life? Man kann stabile Zellinien auch mit Plasmiden basteln, die man so schnell mal eben mittels alkalischer Lyse und iPropOH-Fällung aus einer Miniprep isoliert hat (A260/A280 so um die 1.1. Haha).
Wir haben tatsächlich Leute, die sich um sowas Gedanken machen und immer ganz streng schauen, dass solche Sachen auch passen...
... Ich tendiere aber auch bei Molbio dazu, alles nach Gefühl zu machen, DNA-Mengen nach Aussehen auf dem Gel zu beuteilen (statt zweifelhaftem Nanodrop) und bin damit bisher immer sehr gut gefahren...
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.07.2018, 19:12   #10   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.572
AW: DNA Verunreinigung

Zitat:
Zitat von zarathustra Beitrag anzeigen
Wir haben tatsächlich Leute, die sich um sowas Gedanken machen und immer ganz streng schauen, dass solche Sachen auch passen... ... Ich tendiere aber auch bei Molbio dazu, alles nach Gefühl zu machen, DNA-Mengen nach Aussehen auf dem Gel zu beuteilen (statt zweifelhaftem Nanodrop) und bin damit bisher immer sehr gut gefahren... __________________
Man kann Plasmide auch totreinigen und der Zuliefererindustrie einen monetären Gefallen tun, indem man ihre tollen Kits auch dann verwendet, wenn es weder von der Produktqualität noch von der Zeitersparnis her einen Sinn macht.

Wenn man einen Satz Zellen in einem 3cm Dish transfiziert und dann das, was ein, zwei Wochen G418 überlebt hat, mit ein paar Zellen pro well in 96er verfrachtet um klonale Linien zu selektieren, ist es ziemlich egal, ob man nun 90 oder 95% der ursprünglichen Zellen wegschmeißt...

Edit: Was wirklich nervt, ist verschlepptes Phenol, da es downstream alles Enzymatische killt, aber das riecht man meistens und man bekommt es gut mit PCR cleanup Kits weg. Auch aus dem Restriktionsverdau, den man damit beendet hat.
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Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.

Geändert von imalipusram (17.07.2018 um 19:28 Uhr)
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