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Alt 27.09.2015, 15:29   #1   Druckbare Version zeigen
_elchen_ weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 113
Extraktion von DNA

Hallo !


Ich habe eine sehr, sehr basale Frage, die ich trotz längerem Suchens nie ganz beantworten konnte:

Es geht um die Extraktion von DNA durch Isopropanol:

Nachdem die DNA von den Proteinen getrennt wurde, wird Isopropanol zugegeben und die DNA fällt an der Grenzschicht aus. WARUM? Ich finde immer nur, dass Isopropanol der DNA die Hydrathülle entzieht. Aber warum? Isopropanol (unpolar) und Wasser (polar) reagieren doch gar nicht miteinander und stoßen sich ab, weshalb sollte es dann der DNA die Hydrathülle entziehen?

Und wieso wäscht man DNA anschließend mit Ethanol? Warum Ethanol? Was heißt denn da eigentlich "waschen"? Warum reicht es nicht einfach nach Zugabe von Isopropanol und Zentrifugation den Überstand wegzukippen?

Vielen Dank! Bin auch dankbar für Internetseiten auf denen das wirklich ausführlicher und verständlich erklärt ist!!
_elchen_ ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 27.09.2015, 19:14   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.685
AW: Extraktion von DNA

Zitat:
Zitat von _elchen_ Beitrag anzeigen
Nachdem die DNA von den Proteinen getrennt wurde, wird Isopropanol zugegeben und die DNA fällt an der Grenzschicht aus. WARUM? Ich finde immer nur, dass Isopropanol der DNA die Hydrathülle entzieht. Aber warum? Isopropanol (unpolar) und Wasser (polar) reagieren doch gar nicht miteinander und stoßen sich ab, weshalb sollte es dann der DNA die Hydrathülle entziehen?
Ich bin mir nicht sicher, ob Du da die DNA-Fällung mit Isopropanol und die RNA-Extraktion mit Phenol & Chloroform durcheinander bringst.
Isopropanol ist nicht so hydrophob wie Du annimmst und mit Wasser ist es problemlos mischbar. Insofern gibt es dabei keine Grenzschicht, sondern man hat einfach DNA, die ausfällt.

Zitat:
Zitat von _elchen_ Beitrag anzeigen
Und wieso wäscht man DNA anschließend mit Ethanol? Warum Ethanol? Was heißt denn da eigentlich "waschen"? Warum reicht es nicht einfach nach Zugabe von Isopropanol und Zentrifugation den Überstand wegzukippen?
Wenn Du mit Isopropanol gefällt und abzentrifigiert hast, nimmst Du den Überstand (Wasser und Isopropanol) ab, fügst zum DNA-Pellet 70%-igen Ethanol zu, mischst ein bisschen und zentrifugierst erneut. Das versteht man unter "waschen mit Ethanol".

Das Waschen macht man aus mehreren Gründen. Einerseits will man den verwendeten Alkohol später wieder von der DNA wegbekommen. Ethanol ist offenbar flüchtiger als Isopropanol bzw. lässt sich leichter abdampfen. Ein anderer Grund ist, dass bei der Fällung mit Isopropanol verschiedene Salze mit ausfallen können. Diese sind in 70% Ethanol besser löslich und können daher entfernt werden.

Du könntest jetzt denken, dass Ethanol ja offenbar mehrer Vorteile hat und Dich fragen, warum man dann überhaupt noch einen Isopropanol-Schritt am Anfang macht. Es ist aber wohl so, dass Isopropanol DNA effizienter fällen kann und daher am Anfang sinnvoll eingesetzt werden kann. Danach hat man schon ein DNA-Pellet und wäscht dieses nurnoch mit Ethanol.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 27.09.2015, 22:31   #3   Druckbare Version zeigen
_elchen_ weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 113
AW: Extraktion von DNA

Aber WIESO entzieht denn Isopropanol (oder auch Ethanol) die Hydrathülle? Hat das nichts mit Hydrophilie oder Hydrophobie zu tun? Bzw. damit ob etwas polar oder unpolar ist?
_elchen_ ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 28.09.2015, 06:00   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.070
AW: Extraktion von DNA

Zitat:
Zitat von _elchen_ Beitrag anzeigen
Aber WIESO entzieht denn Isopropanol (oder auch Ethanol) die Hydrathülle? Hat das nichts mit Hydrophilie oder Hydrophobie zu tun? Bzw. damit ob etwas polar oder unpolar ist?
DNA ist in Alkohol-Wasser-Gemischen schlechter löslich als in Wasser. Wenn man wässrige DNA-Lösung mit iPropOH überschichtet, fällt die DNA eben an der Grenzschicht aus, wie in den klassichen Schulversuchen zur DNA-Isolierung aus Hautzellen, Erbsen etc gerne gezeigt wird. In der molekularbiologischen Praxis (in der man mit deutlich geringeren Mengen DNA und kleineren Stücken (Plasmide, cDNA Schnipsel) arbeitet) gibt man den iPropOH zu und mischt, evtl. packt man das auch noch für ein paar Stunden in den Gefrierschrank, um die Fällung zu verbessern.

Das mit der Hydrathülle ist mE ein Erklärungsversuch für die Beobachtung, daß die DNA eben ausfällt. DNA und Alk konkurrieren sicher um das vorhandene Wasser. Ich vermute, daß ein Teil von der DNA gebundenen Wassermoleküle durch Alk ersetzt werden (DNA ist auch lipophil, schau Dir mal die Basen an) und dadurch wird das Gesamtlösungsverhalten beeinflußt. Zusätzlich gibt man noch geeignete Ionen zu, um die negativen Ladungen des Phosphatgerüsts zu kompensieren.
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
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ausfällen, dna, extraktion, präzipitieren

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