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Alt 20.08.2019, 10:31   #1   Druckbare Version zeigen
Strassman Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 258
Wirkstoffkonzentration

Hallo,

Ich habe einen Wirkstoff, dessen wirksame Form (ob protoniert oder unprotoniert) nicht feststeht. Ich bestimme Kd Werte über MST.

Es handelt sich um ein Amin, das in einem PBS Puffer gelöst wird.
Da dies nur bis zu einer bestimmten Konzentration möglich ist, überlegte ich das Hydrochlorid einzusetzten, um weitere Werte messen zu können.

Jetzt meiner Frage:
Ich nehme eine bestimmte Konzentration des Wirkstoffs in deprotonierter Form. Aufgrund des gleiche beleibenden pH Wertes wird sich nach Einstellung des Gleichgewichts eine Verteilung an protonierter und unprotonierter Form einstellen.
Nehme ich jetzt die gleiche Ausgangskonzentration, als protonierten Wirkstoff, würde sich die gleiche Verteilung einstellen (ggfs. sind die Zeiten bis dahin verschieden)

Vorraussetzung: Alles kann vollständig gelöst vorliegen.
Soweit so richtig?

Dann aber: Da der Wirkstoff in protonierter Form (als Salz eingesetzt) in einer höheren Ausgangskonzentration löslich ist, würde ich sobald ich eine höhere Ausgangskonzentration, als die der maximalen Löslichkeit der unprotonierten Form, einsetze, insgesamt mehr protonierten Wirkstoff in Lösung haben?!


Ergo wenn ich nicht weiß ob die protonierte oder unprotonierte Form mit dem Zielprotein interagiert kann ich die gemessenen Werte nicht vergleichen?!

Danke für Hilfe und Anregungen!

Viele Grüße!

Strassman
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"Es gibt Erlebnisse, über die zu sprechen die meisten Menschen sich scheuen, weil sie nicht in die Alltagswirklichkeit passen und sich einer verstandesmäßigen Erklärung entziehen."
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Alt 20.08.2019, 10:51   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

Beim Ziel-pH sollte die Löslichkeit die gleiche sein, egal, ob Du mit der freien Base oder dem HCl-Salz anfängst, denn Du hast ein bestimmtes Verhältnis von beiden Formen, welches durch den pH bestimmt wird. Der einzige Unterschied sollte das Vorhandensein der Chlorid-Ionen sein.
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Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
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Alt 20.08.2019, 11:56   #3   Druckbare Version zeigen
chemiewolf Männlich
Mitglied
Beiträge: 23.065
AW: Wirkstoffkonzentration

Aliphatische Amine sind bei physiologischen pH weitestgehend protoniert. Die WW mit dem Rezeptor ist hiervon unabhängig.
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Alt 20.08.2019, 12:25   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

Nachtrag: Probier mal, die Wirksubstanz als Stammlösung 1:10 in DMSO oder EtOH zu verwenden.
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Alt 20.08.2019, 13:52   #5   Druckbare Version zeigen
chemiewolf Männlich
Mitglied
Beiträge: 23.065
AW: Wirkstoffkonzentration

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Nachtrag: Probier mal, die Wirksubstanz als Stammlösung 1:10 in DMSO oder EtOH zu verwenden.
mit einem Hydrochlorid zu arbeiten (was Standard ist) würde ich in jedem Fall vorziehen.
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Alt 20.08.2019, 15:17   #6   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

Zitat:
Zitat von chemiewolf Beitrag anzeigen
mit einem Hydrochlorid zu arbeiten (was Standard ist) würde ich in jedem Fall vorziehen.
yep. Freie Amine sind bekanntlich meistens etwas labil.
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Alt 20.08.2019, 15:17   #7   Druckbare Version zeigen
Strassman Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 258
AW: Wirkstoffkonzentration

Dankschön so weit, dennoch...



Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Beim Ziel-pH sollte die Löslichkeit die gleiche sein, egal, ob Du mit der freien Base oder dem HCl-Salz anfängst,....

Aber das HCl-Salz ist doch besser löslich bei gleichen pH...?!
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Alt 20.08.2019, 15:30   #8   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

Zitat:
Zitat von Strassman Beitrag anzeigen
Aber das HCl-Salz ist doch besser löslich bei gleichen pH...?!
Ich hatte angenommen, daß das Salz im Vergleich zum Puffer in einer geringen Konz vorliegt. Dann sollte [im Gleichgewicht] doch im Wesentlichen ein Mix aus Base, protonierter Base, evtl. assoziiert mit den Anionen des Puffers vorliegen.
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Alt 20.08.2019, 18:20   #9   Druckbare Version zeigen
Strassman Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 258
AW: Wirkstoffkonzentration

Die Annahme ist ja auch richtig...der pH-Wert wird sich durch das Salz nicht ändern. (da Puffer und da geringe Konzentration)

Ich geh ja auch mit, dass unabhänhig von Einsatz als freie Base oder Salz, die Verteilung aufgrund des eindeutigen pH-Werts gleich ist.

Also Mix aus protonierter Base, Base und -unwesentlich da pharmakologisch nicht beeinflussend- die Chlorid Ionen.

Sagen wir hypothetisch 80% protoniert 20% als freie Base. Beim Einsatz von HCL wird 20% deprotoniert 80% bleiben. Gleiche Menge Base eingesetzt 80% werden protoniert 20% bleiben.

Soweit reicht mein Verständnis.

NUR wenn ich, nun sagen wir eine 20 mM Lösung nur mit dem HCL Salz herstellen kann, da mir beim Einsatz der gleichen Menge als freier Base bereits deutlich Ausfällung zu erkennen ist, dann muss ich doch zwangsläufig eine höhere Konzentration protonierte Base in dem Mix haben. Im GG sind also die 20% freie Base die,DIE maximal löslich sind, der Rest ist protoniert.

Was ist an der Überlegung falsch?!

VG

Strassman
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Alt 20.08.2019, 18:30   #10   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

20mM Lösung im Puffer oder in Wasser? Welche Konz hat Dein Puffer? Hast Du den pH gemessen?
Kannst Du schreiben, um welche Substanz es sich handelt?
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Alt 20.08.2019, 18:53   #11   Druckbare Version zeigen
Strassman Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 258
AW: Wirkstoffkonzentration

Nein kann ich leider nicht.
Die Substanzen sind neu handelt sich um ein Projekt an der Uni.

Puffer ist PBS 7.4. DMSO 10%

20mM war nur so heraus gesagt Zielkonzentration sind in dem genannten Puffer eher bei 1 - 5 mM.
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Alt 20.08.2019, 19:04   #12   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
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Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

Je, nachdem, wie komplex (amphiphil?) das Amin aufgebaut ist, kann ich mir schon vorstellen, daß da makroskopische Effekte auftreten (etwa Aggregation zu "Superstrukturen"), sodaß Du keine idealen solvatisierten Einzelmoleküle im Ansatz hast. Und dann eben unterschiedliches Verhalten beobachtest, wenn Du einmal mit dem Amin anfängst und dann mit dem Salz weitermachst.
PBS hat meiner Erfahrung nach eine recht geringe Pufferkapazität (idR 10mM Phosphat). 5mM Chlorid können da schon einen Unterschied ausmachen, wenn sonst Deine Ammoniumgruppen sich um ein paar Phosphate gruppieren. Wobei, Du hast ja vermutlich jede Menge NaCl (0.9% m/v) drinnen, oder?
Mein Bauch schlägt vor, versuchsweise die Konz der Pufferkomponente zu erhöhen oder einen anderen Puffer auszuprobieren (mit MOPS oder HEPES zB, falls Du mit Zellkulturen arbeitest).
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Alt 20.08.2019, 19:09   #13   Druckbare Version zeigen
Strassman Männlich
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Themenersteller
Beiträge: 258
AW: Wirkstoffkonzentration

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Je, nachdem, wie komplex (amphiphil?) das Amin aufgebaut ist, kann ich mir schon vorstellen, daß da makroskopische Effekte auftreten (etwa Aggregation zu "Superstrukturen"), sodaß Du keine idealen solvatisierten Einzelmoleküle im Ansatz hast.....5mM Chlorid können da schon einen Unterschied ausmachen, wenn sonst Deine Ammoniumgruppen sich um ein paar Phosphate gruppieren....
versuchsweise die Konz der Pufferkomponente zu erhöhen oder einen anderen Puffer auszuprobieren (mit MOPS oder HEPES zB, falls Du mit Zellkulturen arbeitest).
Hoppla, da mutiert die Fragestellung ja ins Unermessliche ...aber ja danke sehr interessant, da ich tatsächlich Probleme mit Aggregatbildung haben, aber wie gesagt ich prüfe nur auf physikochemische Ebene also mit Zellkulturverträglichkeit ist da nix...da bin ich auch raus.

Dankeschonmal nur zurück: Ist nun die Konzentration der protonierten Form tatsächlich höher in angeführten Beispiel?!

VG,

Strassmann
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Alt 20.08.2019, 19:12   #14   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
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Beiträge: 7.190
AW: Wirkstoffkonzentration

Zitat:
Zitat von Strassman Beitrag anzeigen
Dankeschonmal nur zurück: Ist nun die Konzentration der protonierten Form tatsächlich höher in angeführten Beispiel?!
Die sollte nur vom pH abhängen, nach Henderson-Hasselbalch.
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Alt 21.08.2019, 07:18   #15   Druckbare Version zeigen
chemiewolf Männlich
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AW: Wirkstoffkonzentration

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
yep. Freie Amine sind bekanntlich meistens etwas labil.
außerdem kristallisieren sie schlecht oder gar nicht und lassen sich daher auch schlecht abwiegen etc.
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