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Alt 17.09.2019, 13:13   #1   Druckbare Version zeigen
Blaubaerin weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
Kein PCR Produkt im Gel

Hallo ihr Lieben,
ich stehe kurz vor dem Wahnsinn.
Ich führe für meine Bachelorarbeit eine PCR durch. Zunächst lief auch alles nach Schema F ab. PCR, Gelelektrophorese, Banden auswerten etc.
Dann kam der Tag und es war keine einzige Bande zu sehen. Aus welchem Grund auch immer.
Mein Betreuer hat gemerkt, dass sich der Cycler verstellt hat. Es waren also weniger Durchgänge als erforderlich. Er hat dies korrigiert und welch Überraschung meine Negativkontrolle war positiv.
Durch Austauschen einzelner Komponenten habe ich versucht die Negativ Kontrolle wieder positiv zu bekommen. Das Austauschen blieb erfolglos ^^
Während ich 3 Tage im Urlaub war, haben zwei Kolleginnen alle Reagenzien noch mal ausgetauscht und hatten im Agarose Gel keine Bande.
Gestern habe ich mit einer anderen Kollegin den Versuch wiederholt, um einfach mögliche Fehler beim pipettieren zu erkennen, aber auch dieser blieb erfolglos.
Ich habe heute meine alten Primer genommen, weil die Pcr damit bei mir funktioniert hat und habe erneut eine PCR durchgeführt, auch diese PCR blieb erfolglos.
Hat jemand einen winzigen Ansatz was man versuchen könnte?
LG von einer sehr verzweifelten Studentin
Blaubaerin ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.09.2019, 13:48   #2   Druckbare Version zeigen
Peter Schulz  
Mitglied
Beiträge: 618
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Kannst du hier mal schauen unter "no product":


https://international.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/pcr-troubleshooting-guide


Peter Schulz ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.09.2019, 14:01   #3   Druckbare Version zeigen
Thrips  
Mitglied
Beiträge: 79
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Geht der Cycler? Auch das habe ich schon erlebt. Einfach mal während der PCR öffnen und VORSICHTIG (94/72° sind heiss!)auf den Heizblock fassen...
Thrips ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.09.2019, 14:02   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.190
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Primer oder dNTPs kaputt oder eine DNAse im Puffer (mikrobielle Kontamionation?). In Ergänzung zu Peter idealerweise mit einer bekannt funktionierenden Reaktion testen, damit man Primer und Template trauen kann.
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.09.2019, 14:08   #5   Druckbare Version zeigen
Blaubaerin weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Zitat:
Zitat von Thrips Beitrag anzeigen
Geht der Cycler? Auch das habe ich schon erlebt. Einfach mal während der PCR öffnen und VORSICHTIG (94/72° sind heiss!)auf den Heizblock fassen...
Also im Cycler gibt es noch weitere PCR Programme. Ich habe meinem Betreuer vorgeschlagen, dass ich morgen noch mal eine andere PCR mache, um zu sehen, ob es tatsächlich der Cycler oder einfach nur meine 16S PCR ist.
Blaubaerin ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.09.2019, 14:10   #6   Druckbare Version zeigen
Blaubaerin weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Primer oder dNTPs kaputt oder eine DNAse im Puffer (mikrobielle Kontamionation?). In Ergänzung zu Peter idealerweise mit einer bekannt funktionierenden Reaktion testen, damit man Primer und Template trauen kann.
Ich habe tatsächlich auch die dNTP in Verdacht, da die Polymerase ganz frisch ist. Dankeschön für deine Antwort
Blaubaerin ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 17.09.2019, 14:11   #7   Druckbare Version zeigen
Blaubaerin weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 4
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Zitat:
Zitat von Peter Schulz Beitrag anzeigen
Danke für die Seite, ich habe ewig nach einer gesucht, die sowas knapp zusammenfasst.
Blaubaerin ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.09.2019, 16:11   #8   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.696
AW: Kein PCR Produkt im Gel

Mir ist nicht ganz klar, was da eigentlich geändert wurde und würde die Aufmerksamkeit mal auf die PCR-Bedingungen lenken:

Ein Thermocycler verstellt sich i.d.R. nicht selbst, sondern es hat vermutlich jemand euer Programm für eine andere PCR verwendet. Dann würde ich davon ausgehen, dass auch die Zeiten oder Temperaturen verändert wurden.

Wenn ihr das gleiche PCR-Tube einfach noch mal in den Thermocycler gestellt habt und ein neues Programm laufen gelassen habt, dann würde es mich auch nicht wundern, wenn ihr falsch-positive Ergebnisse erhalten habt.

Ebenso wäre das nicht verwunderlich, falls wirklich jemand die Annealing-Temperatur runtergesetzt hatte und ihr einfach eine unspezifische Amplifikation habt, weil die Primer bei der niedrigen Temperatur unspezifisch binden.

Ich würde tatsächlich eine andere PCR ausprobieren oder - alternativ - deine PCR wiederholen und dabei das Temperaturprogramm so ändern, dass du eine touchdown-PCR hast. Davor solltest du natürlich nochmals alle anderen Parameter überprüfen.

Bei dNTPs lohnt es sich, ein neues Gefäß aufzutauen, die dNTPs in kleine Eppis zu aliquotieren und diese einzufrieren. Dann verwendet man ein Eppi vielleicht 2-3 x, bevor es leer ist und vermeidet damit Einfrier-Auftau-Zyklen.

Grüße,
Zara
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
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pcr gelelektrophorese

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