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Alt 20.06.2008, 11:12   #1   Druckbare Version zeigen
RapBo  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 2
Transformation E.coli

Vorgestern habe ich eine Transformation (15min auf Eis, Hitzeschock 40 sec 42°C, 5 min Eis, auf LB-Platten mit Ampicillin ausplattiert) von drei Plasmiden (gleiche Vektoren, nur andere Inserts)in E.coli BL21(DE3) gemacht. Dabei die gleiche DNA-Menge (ca. 300 ng) und gleiche BAkterienanzahl eingesetzt. In zwei der drei Fälle ca. 50 Kolonien, im dritten Fall eine einzige Kolonie nach Übernachtinkubation bei 37°C erhalten. Ich habe die Transformation wiederholt, indem ich die doppelte Menge an DNA für das dritte Plasmid genommen habe, leider mit dem gleichen ergebnis.
Hat jemand eine Idee, woran das liegen könnte?
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Alt 20.06.2008, 11:16   #2   Druckbare Version zeigen
Matzi Männlich
Mitglied
Beiträge: 4.463
AW: Transformation E.coli

Hast du neu kloniert/ligiert? Ansonsten auch insbesondere die Ligation mal wiederholen. Oder waren die Plasmide schon fertig und du wolltest nur neue Bakterien hochziehen?
__________________
Ego vero fateor me his studiis esse deditum.
(Cicero)
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Alt 20.06.2008, 11:19   #3   Druckbare Version zeigen
RapBo  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 2
AW: Transformation E.coli

Die Plasmide sind alle schon kontrollsequenziert. Ich wollte halt jetzt in BL21 transformieren um zu exprimieren.
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Alt 20.06.2008, 11:31   #4   Druckbare Version zeigen
ehemaliges Mitglied  
nicht mehr Mitglied
Beiträge: n/a
AW: Transformation E.coli

Mein erster Tip wäre die Bildung eines toxischen Genproduktes.

Jaja, ich weiß: BL21, T7-Promotor.
Aber es könnte auch sein, dass im Insert ein unerkannter E.coli-Promotor liegt.

Schon Minipräps gemacht und das reisolierte Konstrukt gecheckt?
Falls das OK ist, würd ich mir keinen weiteren Kopf drum machen.

Gruß
CCC
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Alt 20.06.2008, 18:15   #5   Druckbare Version zeigen
sonnending weiblich 
Mitglied
Beiträge: 428
AW: Transformation E.coli

Huhu!

Hast du die DNA vorher mal auf dem Gel gecheckt? Vielleicht hast du DNasen drin, und es ist nicht mehr wirklich viel brauchbarer Vektor da. 300ng ist ja für ne Retrafo schon ein ganzer Haufen.
Ansonsten, wie schon gesagt wurde, checken, ob die zwei die richtigen sind, und dann ist gut. Mein Lieblingsspruch mein Klonieren "Einer reicht"

lg
sonnending ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 20.06.2008, 18:51   #6   Druckbare Version zeigen
Matzi Männlich
Mitglied
Beiträge: 4.463
AW: Transformation E.coli

Zitat:
Ansonsten, wie schon gesagt wurde, checken, ob die zwei die richtigen sind, und dann ist gut. Mein Lieblingsspruch mein Klonieren "Einer reicht"
So wie ich das verstanden habe, sind das unterschiedliche Klonierungen gewesen:
Zitat:
von drei Plasmiden (gleiche Vektoren, nur andere Inserts)
Insofern ist es vielleicht schon ein wichtiger Ansatz...
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(Cicero)
Matzi ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 20.06.2008, 20:01   #7   Druckbare Version zeigen
sonnending weiblich 
Mitglied
Beiträge: 428
AW: Transformation E.coli

Da hast du mich falsch interpretiert, ich meinte eine Kolonie (mit dem richtigen Insert) reicht, ...

Wie ich das verstanden habe, waren alle Konstrukte schon kloniert und sollten nur retransformiert werden.

lg
sonnending ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 20.06.2008, 20:05   #8   Druckbare Version zeigen
Matzi Männlich
Mitglied
Beiträge: 4.463
AW: Transformation E.coli

Ah, ok... sorry.
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Ego vero fateor me his studiis esse deditum.
(Cicero)
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Alt 16.01.2010, 08:44   #9   Druckbare Version zeigen
FASCINADOR weiblich 
Mitglied
Beiträge: 3
AW: Transformation E.coli

Hallo..Kann mir jemand helfen?? ich bin hier neu und kenn mir nicht aus..brauche hilfe ..werde am freitag e-coli transformation machen was soll i da tun wie gehts vor?
FASCINADOR ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 16.01.2010, 11:48   #10   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.697
AW: Transformation E.coli

Zitat:
Zitat von FASCINADOR Beitrag anzeigen
Hallo..Kann mir jemand helfen?? ich bin hier neu und kenn mir nicht aus..brauche hilfe ..werde am freitag e-coli transformation machen was soll i da tun wie gehts vor?
Schau, was für kompetente Zellen Du im Labor zur Verfügung hast und such Dir ein Protokoll des Herstellers raus.
Wir arbeiten z.B. mit diesen hier:
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/subcloningefficiencydh5alpha_man.pdf

Für die Transformation tauen wir die E. coli-Zellen auf Eis auf, geben die Plasmid-DNA zu und inkubieren 20-30 min auf Eis. Dann wird das Cap mit den Zellen für 20 sec in ein 42°C Wasserbad gegeben, für 2 min auf Eis abgekühlt und LB-Medium ohne Antibiotika zugegeben! Dann inkubiert man ca. 60 min bei 37°C, dabei haben die Bakterien dann Zeit, das auf Deinem Plasmid codierte Resistenzgen zu exprimieren. Erst dann werden die Bakterien auf Agar-Platten mit Antibiotikum ausgestrichen.

Aber such Dir das Manual zu Euren kompetenten Bakterien raus und lass Dir die Prozedur von jemandem in Deinem Labor zeigen, der das schonmal gemacht hat.

Gruß,
Zara
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.01.2010, 09:48   #11   Druckbare Version zeigen
FASCINADOR weiblich 
Mitglied
Beiträge: 3
AW: Transformation E.coli

nein habe ich sows noch nie gemacht...das ist mein allererstes mal..und alles was ich heraus gefunden habe ist auf englisch ..naja meine schwäche..bin eine slowakin kenne viele andere sprache
aber zu englisch bin ich in meiner schule nie gekommen u daher habe i natürlich überall schwierigkeiten...aber danke für hilfe ..
FASCINADOR ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.01.2010, 23:10   #12   Druckbare Version zeigen
Matzi Männlich
Mitglied
Beiträge: 4.463
AW: Transformation E.coli

Was genau machst du denn? Studium? Fach?

Dann solltest du versuchen, im Englischen so fit zu werden, dass du entsprechende Arbeitsanweisungen und paper auch verstehst.

Zum Einstieg ins Labor - wenn es nicht nur bei Transformation bleibt, sondern du auch viele andere Techniken anwenden musst in naher Zukunft - gibt es aber auch deutsche Literatur, die hilft, zum Beispiel die Bücher der Experimentator-Reihe aus dem Spektrum-Verlag.
__________________
Ego vero fateor me his studiis esse deditum.
(Cicero)
Matzi ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.01.2010, 23:22   #13   Druckbare Version zeigen
aspergillus Männlich
Mitglied
Beiträge: 467
AW: Transformation E.coli

Man muss übrigens keine fertigen kompetenten kaufen, die kann man sich auch selber kompetent machen.
aspergillus ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 17.01.2010, 23:26   #14   Druckbare Version zeigen
FASCINADOR weiblich 
Mitglied
Beiträge: 3
AW: Transformation E.coli

tja ich mache mein chemie collage biochemie und wir haben jetzt diese aufgabe bekomen ;((( u natürlich weiss ich dass englisch notwendig ist ..sogar sehr..aber irgentwie komm ich nicht dazu tagsüber arbeite ich volltime und am abend von 17.30 bis 22 h schule tag täglich ...;( aber ich wil es schafen
FASCINADOR ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 12.09.2019, 21:17   #15   Druckbare Version zeigen
stammzellkoenigin  
Mitglied
Beiträge: 1
AW: Transformation E.coli

Hallöchen zusammen,

ich werfe hier mal kurz folgendes ein:
Nach dem Hitzeschock, wie lange bekommt es den E.coli auf Eis? 30s 42•, dann 8min auf Eis & vorm Plattieren 1,5h 37• in Soc.
Zudem habe ich die E.coli etwas grob mit DNA vorm Hitzeschock gemischt...

Sind das so grobe Fehler, die meinen Versuch komplett hinrichten?

Würde mich über ne Info freuen

LG

Allen auf jeden Fall ganz viel Erfolg bei der Laborarbeit
stammzellkoenigin ist offline   Mit Zitat antworten
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