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Alt 21.04.2010, 20:58   #1   Druckbare Version zeigen
gummibaerchen.ce  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 9
PCR Kontaminationsprobleme

Hallo zusammen,

wir haben im Labor folgendes Problem und ich würde mich sehr freuen, wenn jemand was dazu sagen könnte.

Bei der RT-PCR aus humaner RNA haben wir arge Kontaminationsprobleme. In der nachfolgenden PCR sind die bei der RT-PCR mit angesetzten Negativkontrollen zu ca. 90% positiv.

Ich arbeite noch nicht so lange dort und kenne solche Probleme nicht in dieser massiven Weise.

Frage: kann es sein, dass es zu diesen Kontaminationen kommt, da wir selbstgesteckte Pipettenspitzen verwenden? Soweit ich weiß, zerstört die nachfolgende Autoklavierung der Spitzen doch nicht die DNA, mit denen man die Spitzen beim Stecken evtl. kontaminiert?

Hier noch ein paar Nebeninfos:
- wir benutzen gestopfte Pipettenspitzen
- pipettieren unter einer Hood (nicht angestellt), haben aber keinen Arbeitsbereich, an dem nur mit RNA gearbeitet wird

Falls ihr noch Infos benötigt, sagt einfach Bescheid!

Viele Grüße
Christina
gummibaerchen.ce ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 22.04.2010, 15:59   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.674
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Zitat:
Zitat von gummibaerchen.ce Beitrag anzeigen
Bei der RT-PCR aus humaner RNA haben wir arge Kontaminationsprobleme. In der nachfolgenden PCR sind die bei der RT-PCR mit angesetzten Negativkontrollen zu ca. 90% positiv.
Ich frage mich, was das für Kontaminationen sein können.
Hast Du nach der RNA-Extraktion einen DNase-Verdau? Und verwendest Du Exon-spanning-Primer? Wenn nicht, könnte es sich um eine Kontamination durch genomische DNA handeln...

Zitat:
Zitat von gummibaerchen.ce Beitrag anzeigen
Frage: kann es sein, dass es zu diesen Kontaminationen kommt, da wir selbstgesteckte Pipettenspitzen verwenden? Soweit ich weiß, zerstört die nachfolgende Autoklavierung der Spitzen doch nicht die DNA, mit denen man die Spitzen beim Stecken evtl. kontaminiert?
Ob das der Grund für Eure Probleme ist, kann ich nicht sagen. Aber wenn Du einfach mal die gesamte RNA-Aufreinigung und RT mit allen Reagenzien durchführst, aber gar keine Zellen bzw. kein Gewebe zusetzt, dürftest Du keine RNA haben. Damit solltest Du auch keine cDNA bekommen und kein Signal. Falls Du aber trotzdem was sehen solltest, weißt Du, dass Du von irgendwo eine Kontamination reinbekommst.

Eine gute Kontaminationsquelle können die Pipetten selbst sein. Ich weiß nicht, was Du mit "gestopften" Pipettenspitzen, die Ihr "selber stopft" meinst, aber Du solltest auf jeden Fall mal Filterspitzen ausprobieren. Hilfreich ist es auch, einen eigenen Satz Pipetten zu nehmen, der nur für das Ansetzen der RT- und PCR-Reaktionen verwendet wird. Diesen Satz solltest Du nicht nach der PCR einsetzen. Denn wenn Du die Pipetten mit kleinen Mengen des Produktes kontaminierst, kannst Du es beim nächsten Ansatz der PCRs einschleppen...
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 22.04.2010, 22:14   #3   Druckbare Version zeigen
Importabteilung Männlich
Mitglied
Beiträge: 677
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Habt ihr die Bereiche räumlich getrennt? Tubes mit PCR Produkten sollen optimaler Weise nicht im gleichen Raum sein (v.a. geöffnet werden) in dem die RNA extraktion etc gemacht wird?

Ich wusste gar nicht, dass man Filterspitzen autoklavieren kann. Ist der Filter danach nicht kaputt?
Importabteilung ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 23.04.2010, 07:15   #4   Druckbare Version zeigen
ehemaliges Mitglied  
nicht mehr Mitglied
Beiträge: n/a
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Noch ein paar gedanken
Primer ueber Exon/Intron Grenzen legen, wurde schon genannt
Primer in die 3' Richtung des Gens legen und cDNA statt (falls) mit random Hexamer Primern lieber mit oligo dT Primern herstellen, so wird ausschlisslich mRNA transkribiert.
Autoklavieren hilft nicht gegen DNA Kontamination. Ich denke gerade wenn man hier den analytischen Nachweis fuer eine Transkript in einer Probe fuehren will, ist es am falschen Ende gespart Spitzen selbst zu stecken und mit Kontaminationen zu leben die Ergebnisse sind fuer die Tonne, das ist teurer als die besten Spitzen...
Wenn etwas hilft waere das UV Licht aber bei Spitzen waere mit nicht klar wie Kontaminationen innen damit erreicht wuerden.
Fuer analytische PCR ist das Arbeiten mit dem selben Gen in Plasmiden, im selben Raum toedlich, da reicht keine abgestellte Hood sondern hoechstens ein eingehauster PCR Arbeitsplatz mit entsprechender UV Dekontamination, getrennte Pipetten und Ausfuehrende die peinlich genau auf "Sauberkeit" achten.
Bei menschlicher DNA Kontamination: Handschuhe, Aermlinge und Kittel, Proben hinter einem Schirm. Handschuehe und Aermelschoner regelmaessig Wechseln.
Und natuerlich muessen auch die Spitzen, wenn schon, unter diesen Bedingungen gesteckt werden und vorallem bei aussreichender Luftfeuchtigkeit sodass nicht durch elektrostatische Aufladung des Plastikzeugs Hautschuppen etc aus der Laborluft angezogen werden.
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Alt 24.04.2010, 15:43   #5   Druckbare Version zeigen
gummibaerchen.ce  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 9
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Ganz lieben Dank für eure Anregungen!
Hier noch ein paar Anmerkungen:
-wie die Primer designt sind, weiß ich leider nicht genau
-wir nutzen Random-Primer, keine Oligo-DT
-bei uns finden ALLE Arbeiten in einem Raum an wechselnden Arbeitsplätzen statt. Es gibt keinen RNA-Arbeitsplatz, keine getrennten Pipetten, es wird ohne Kittel gearbeitet
-mit "gestopfte Spitzen" meine ich Filterspitzen. Sie sind auf jeden Fall autoklavierbar

Wahrscheinlich wird es eine Kombination aller Faktoren sein, dass wir diese Kontaminationsprobleme haben ...
Ich werde zunächst mal anregen, dass wir die RNA-Arbeiten auslagern. Mal schauen, ob wir auch fertige Pipettenspitzen kaufen könnten ...

Vielen Dank noch mal!
Christina
gummibaerchen.ce ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 25.04.2010, 07:20   #6   Druckbare Version zeigen
ehemaliges Mitglied  
nicht mehr Mitglied
Beiträge: n/a
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Das Problem sind sicher am wenigsten die RNA Arbeiten, die sind fuer sich problematisch in so einer Umgebung, der RNA wegen und moeglicher Degradation durch RNasen, aber nicht in Hinblick auf die Kontaminationen.
Meine primaeren Tipps: Primerdesign ueber Exongrenzen im 3' Bereich und oligo dT cDNA damit wird schoneinmal ein gut Teil der Kontaminationsquellen ausgeschlossen, egal wie schludrig sonst gearbeitet wird.
Eine ausgewiesener und abgeschlossener Bereich um die PCRs zu pippetieren der mit UV Licht dekontaminiert werden kann und mit entsprechenden DNA zerstoerenden Putzmitteln gereinigt wird (Javellwasser/Chlorbleiche, H2O2, spezielles Zeug wie DNA-Zap oder dergl.) und zwar, wenn das Kontaminationsproblem anhaelt, vor und nach jedem Experiment und Experimentator.
Ohne Kittel mit menschlichem Material.....
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Alt 25.04.2010, 10:51   #7   Druckbare Version zeigen
gummibaerchen.ce  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 9
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Danke MoHe!
gummibaerchen.ce ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 26.04.2010, 08:13   #8   Druckbare Version zeigen
Uller Männlich
Mitglied
Beiträge: 1.003
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Ich habe noch nicht ganz verstanden, ob die Negativ-Kontrollen technische Kontrollen sind (also RT-PCR ohne template) oder biologische Kontrollen (z.B. Genexpression des Transkripts nicht induziert).

Wenn eine technische Kontrolle ohne Bande bleibt, kann man sich die Kontaminationssuche sparen und muss seinen experimentellen Aufbau überdenken.
__________________
Zwei Dinge sind unendlich: Das Universum und die menschliche Dummheit. Bezüglich des Universums bin ich mir aber noch nicht ganz sicher.
- Albert Einstein -
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Alt 26.04.2010, 14:40   #9   Druckbare Version zeigen
gummibaerchen.ce  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 9
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Es handelt sich um eine Negativkontrolle ohne Template.
gummibaerchen.ce ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 04.05.2019, 14:42   #10   Druckbare Version zeigen
weso Männlich
Mitglied
Beiträge: 2
AW: PCR Kontaminationsprobleme

Zitat:
Zitat von gummibaerchen.ce Beitrag anzeigen
Hallo zusammen,

wir haben im Labor folgendes Problem und ich würde mich sehr freuen, wenn jemand was dazu sagen könnte.

Bei der RT-PCR aus humaner RNA haben wir arge Kontaminationsprobleme. In der nachfolgenden PCR sind die bei der RT-PCR mit angesetzten Negativkontrollen zu ca. 90% positiv.

Ich arbeite noch nicht so lange dort und kenne solche Probleme nicht in dieser massiven Weise.

Frage: kann es sein, dass es zu diesen Kontaminationen kommt, da wir selbstgesteckte Pipettenspitzen verwenden? Soweit ich weiß, zerstört die nachfolgende Autoklavierung der Spitzen doch nicht die DNA, mit denen man die Spitzen beim Stecken evtl. kontaminiert?

Hier noch ein paar Nebeninfos:
- wir benutzen gestopfte Pipettenspitzen
- pipettieren unter einer Hood (nicht angestellt), haben aber keinen Arbeitsbereich, an dem nur mit RNA gearbeitet wird

Falls ihr noch Infos benötigt, sagt einfach Bescheid!

Viele Grüße
Christina
Hallo Christina, du hast ganz recht, die Autoklavieren ist kein sicheres Verfahren um PCR Amplifikation der DNA zu verhindern. Das Aukoklavieren zerstört die DNA nur teilweise. Der Taq DNA Polymerase reichen aber wenige DNA Moleküle die noch über die Länge deiner amplifizierten Sequenz intakt sind. Daher besser keine selbstgesteckten Spitzen am besten Filterspitzen verwenden. Autoklavieren von Plastikwaren egal ob PCR Tubes oder Spitzen kannst du dir daher sparen. Dagegen ist ein PCR Cabinet sinnvoll. Eine einfache, preisgünstige Workstation mit einer UV Röhre [...] ist dabei oft besser als Systeme mit Luftzirkulation da diese Verwirbelungen verursachen. Wichtig ist: an deinem PCR Arbeitsplatz solltest Du niemals Plasmid DNA oder bereits PCR amplifizierte Proben pipettieren. Lg Weso

Geändert von zarathustra (04.05.2019 um 20:00 Uhr) Grund: Werbung entfernt
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