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Alt 25.07.2017, 13:49   #1   Druckbare Version zeigen
Anudoranador Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 31
Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Hi,

ich habe ein relative großes Enzym (γ-Glutamyltransferase) und ein Dipeptid (Cys-Gly)in einer Puffer-Lösung vorliegen und möchte das Enzym (was ich nicht mehr brauche) abtrennen.

Mein Gedankengang war Zentrifugieren. Das Enzym setzt sich als Pellet unten ab und die Lösung mit dem Dipeptid dekantiere ich ab.

Jetzt hätte ich eventuell eine normale Tischzentrifuge zur Verfügung. Die schafft circa 3000g. Setzt sich damit das Enzym ab oder brauche ich eine Ultrazentrifuge dafür?
Ich weiss, keiner kann hellsehen, aber vielleicht hat da ja jemand Erfahrungswerte oder ein Bauchgefühl.

Grüße
Anudoranador ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 25.07.2017, 14:21   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra Männlich
Moderator
Beiträge: 11.536
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Um es kurz zu machen:
Auch mit einer Ultrazentrifuge wirst du "normale" Proteine nicht als Pellet erhalten, mit einer Zentrifuge definitiv nicht.

Um dir mal einen Vergleich zu geben:
Wenn du z.B. Zellbestandteile über Zentrifugation fraktionierst, kannst du mit 1 000 g die Zellkerne pelletieren, mit 10 000 g bekommst du Mitochondrien ins Pellet und Mikrosomen bei 100 000 g. Da bist du bei Weitem nicht bei der Größe von Proteinen.

Große Proteinkomplexe kann man mit einer Ultrazentrifuge durch Sucrosegradienten o.ä. zentrifugiert und damit auftrennen. Es gibt zwar Leute, die bspw. bei Proteinaufreinigungen bei 5 000 g bis 10 000 g zentrifugieren, um Protein-Aggregate loszuwerden, aber so wirklich effizient ist das nicht und eine Ultrazentifugation ist da sinnvoller. Insofern nehme ich auch nicht an, dass du dein Enzym denaturieren und abzentrifugieren kannst.

Mit welchen Mengen (Volumen und Konzentration) arbeitest du denn? Du hast doch vermutlich nur sehr wenig Enzym vorhanden (katalytische Mengen) und ich frage mich, ob das überhaupt deine folgenden Versuche stört. Wenn dich die enzymatische Aktivität stört, reicht es ja vielleicht, die Lösung mal auf 50-60°C zu erhitzen,
das Dipeptid wird das kaum stören, während das Enzym danach vermutlich kaputt ist.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 25.07.2017, 16:36   #3   Druckbare Version zeigen
Anudoranador Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 31
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Zitat:
Wenn du z.B. Zellbestandteile über Zentrifugation fraktionierst, kannst du mit 1 000 g die Zellkerne pelletieren, mit 10 000 g bekommst du Mitochondrien ins Pellet und Mikrosomen bei 100 000 g. Da bist du bei Weitem nicht bei der Größe von Proteinen.
Wow ok. Das hätte ich jetzt nicht vermutet, da in papern dieses Enzym angeblich mit 10000-20000 g abgetrennt wurde.

Zitat:
Mit welchen Mengen (Volumen und Konzentration) arbeitest du denn? Du hast doch vermutlich nur sehr wenig Enzym vorhanden (katalytische Mengen) und ich frage mich, ob das überhaupt deine folgenden Versuche stört. Wenn dich die enzymatische Aktivität stört, reicht es ja vielleicht, die Lösung mal auf 50-60°C zu erhitzen,
das Dipeptid wird das kaum stören, während das Enzym danach vermutlich kaputt ist.
Es handelt sich um eine enzymatische Spaltung (genauer: Transpeptidierung) von einem Tripeptid zu einem Dipeptid.
Ich hab 500 µL Tripeptid (10 mM) und 50 µL Enzym (10 Units ≙ 1,25 mg). Das alles in einer Pufferlösung mit Akzeptormolekül (Gly-Gly, 50 µL, 200 mM). Das entstandende Dipeptid wird anschliessend derivatisiert und mittels GC-MS vermessen, um zu sehen obs geklappt hat.

Idee: Ich dachte mir, dass das Enzym beim Aufarbeitungsschritt der Derivatiserung sowieso rausgeht, da ich das Produkt dann mit Ethylacetat extrahiere. Somit müsste mein Enzym doch in der wässrigen Phase zurückbleiben?

Sollte ich die Suppe vorher auf 50°C erhitzen, damit das Enzym bei der Derivatisierung (Methylierung der Carboxyl-Gruppe der Cystein-Einheit mit SOCl2/MeOH) nicht stört?
Anudoranador ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 25.07.2017, 17:51   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 5.857
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Wenn Du SOCl2 auf den Mix wirfst, fangen Dir die Reste des Enzyms (Aminogruppen!) das Reagenz weg, egal, ob Du denaturierst oder nicht. Das Protein muß demnach weg!

Wenn Du das Produkt mit EtOAc extrahierst, sollte das Enzym eigentlich in der wässrigen Phase bleiben und nicht weiter stören.

Falls das nicht helfen sollte, würde ich zu einer Gelfiltration mit Sephadex G25 raten. Hat eine Ausschlussgrenze von 10kD. Gibts auch fertig gepackt als Spinsäulchen oder mit gravity flow, für Probenvolumina von ca. 50µl bis mehrere ml. Schau mal bei Sigma, GE oder Roche. Eine Alternative dazu sind Membrankonzentratoren, zB Vivaspin von Sartorius. Die halten das Enzym zurück, während kleine Moleküle durch die Membran gehen.

Just curious: Was ist alles in Deinem Reaktionspuffer drinnen?
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.

Geändert von imalipusram (25.07.2017 um 18:01 Uhr)
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 25.07.2017, 18:18   #5   Druckbare Version zeigen
zarathustra Männlich
Moderator
Beiträge: 11.536
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Zitat:
Zitat von Anudoranador
Es handelt sich um eine enzymatische Spaltung (genauer: Transpeptidierung) von einem Tripeptid zu einem Dipeptid.
Ich hab 500 µL Tripeptid (10 mM) und 50 µL Enzym (10 Units ≙ 1,25 mg). Das alles in einer Pufferlösung mit Akzeptormolekül (Gly-Gly, 50 µL, 200 mM). Das entstandende Dipeptid wird anschliessend derivatisiert und mittels GC-MS vermessen, um zu sehen obs geklappt hat.
Okay, ich hatte mir Sorgen gemacht, dass du mit wirklich großen Mengen und präparativ arbeiten willst, aber in dem Maßstab kann man ja echt unkompliziert arbeiten - und imalipusram hat dir die beiden besten Methoden schon genannt.

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Falls das nicht helfen sollte, würde ich zu einer Gelfiltration mit Sephadex G25 raten. Hat eine Ausschlussgrenze von 10kD. Gibts auch fertig gepackt als Spinsäulchen oder mit gravity flow, für Probenvolumina von ca. 50µl bis mehrere ml.
An sowas hatte ich auch gedacht, PD-10 Säulen sind perfekt für Volumina um 500 µl. Eigentlich verwendet man sowas, um Proteine umzupuffern. Die Säule wird mit dem gewünschten Puffer äquilibriert, man gibt oben das Protein drauf, lässt es einlaufen, gibt 500 µl Puffer drauf, fängt den Durchfluss auf, gibt wieder 500 µl, fängt den Durchfluss auf usw. Das Protein kommt zuerst aus der Säule, danach die kleineren Probenbestandteile, in deinem Fall das Dipeptid. Wahrscheinlich müsstest du die Probe nicht mal aufkonzentrieren, sondern könntest sie direkt für die Derivatisierung nehmen.

Zitat:
Zitat von imalipusram Beitrag anzeigen
Eine Alternative dazu sind Membrankonzentratoren, zB Vivaspin von Sartorius. Die halten das Enzym zurück, während kleine Moleküle durch die Membran gehen.
Sowas ist auch super und wird meist verwendet, um Proteine aufzukonzentrieren. Probe oben rein, zentrifugieren, kleine Bestandteile mit Puffer kommen unten raus.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 25.07.2017, 18:51   #6   Druckbare Version zeigen
Anudoranador Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 31
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Zitat:
Wenn Du SOCl2 auf den Mix wirfst, fangen Dir die Reste des Enzyms (Aminogruppen!) das Reagenz weg, egal, ob Du denaturierst oder nicht. Das Protein muß demnach weg!
Auch wenn ich einen sehr großen Überschuss einsetze? Ich mein die Reaktion ist nicht stöchiometrisch - man braucht halt einfach einen großen Überschuss an SOCl2. Wenn ich genug SOCl2 dazugebe, dass Enzym sowie Dipeptid abgesättigt sind?

Ansonsten wären warscheinlich Membrankonzentratoren mMn die beste Lösung. Allerdings muss ich diesen Schritt öfter machen. Da stellt sich dann die Frage der Wirtschaftlichkeit. Ist das Einweg-Material? Das muss ich mal durchrechnen.

Zitat:
Was ist alles in Deinem Reaktionspuffer drinnen?
Phosphatpuffer: Na2HPO4/KH2PO4, 200 mM, pH = 8.
Anudoranador ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 26.07.2017, 03:34   #7   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 5.857
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Zitat:
Zitat von Anudoranador Beitrag anzeigen
Auch wenn ich einen sehr großen Überschuss einsetze? Ich mein die Reaktion ist nicht stöchiometrisch - man braucht halt einfach einen großen Überschuss an SOCl2. Wenn ich genug SOCl2 dazugebe, dass Enzym sowie Dipeptid abgesättigt sind?
du kannst das natürlich austritrieren. Wasser ist ja auch noch da, welches Dir einen Teil des Thionylchlorids hydrolysiert.

Zitat:
Zitat von Anudoranador Beitrag anzeigen
Ansonsten wären warscheinlich Membrankonzentratoren mMn die beste Lösung. Allerdings muss ich diesen Schritt öfter machen. Da stellt sich dann die Frage der Wirtschaftlichkeit. Ist das Einweg-Material? Das muss ich mal durchrechnen.
Sowohl Sephadex als auch Membrankonzentratoren kann man wieder verwenden. Man muss nur aufpassen, daß man sich keine Kreuzkontamination einfängt.
Spülen (zB über Nacht stehen assen und dann auswaschen) mit 1M NaCl tut gut, zum Aufbewahren benetze ich die Membranen mit etwas Glycerol (10% oder so) mit 0.1% NaN3 als Konservierungsmittel. Vor Gebrauch muß das natürlich wieder ausgewaschen werden. Für Sephadex geht 20% Ethanol (nicht mehr) oder PBS-Azid.

Zitat:
Zitat von Anudoranador Beitrag anzeigen
Phosphatpuffer: Na2HPO4/KH2PO4, 200 mM, pH = 8.
Gut. Ich wollte nur sicherstellen, daß da nicht aus Versehen Tris oder ein anderes Amin drin ist.
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I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 27.07.2017, 08:54   #8   Druckbare Version zeigen
jlennonscola  
Mitglied
Beiträge: 1
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Eine TCA Fällung um das Enzym abzutrennen, könnte die einfachste Lösung sein.
jlennonscola ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 07.08.2017, 11:15   #9   Druckbare Version zeigen
Anudoranador Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 31
AW: Enzym bei 3000g zentrifugieren - reicht das?

Hi,
ich wollte nur ein kurzes Update geben und mich für die Hilfe bedanken. Ich habe Membrankonzentratoren (mit Cut Off Filter 10kDa) in einer Ultrazentrifuge (12500g, 40min) verwendet. Das Ganze hat super funktioniert, das Enzym war nach jedem Schritt abgetrennt und ich habe mein gewünschtes Produkt erhalten.
Vielen Dank für die Hilfe!
Anudoranador ist offline   Mit Zitat antworten
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enzym, peptid, zentrifuge, zentrifugieren

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