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Alt 05.10.2018, 10:41   #1   Druckbare Version zeigen
Mariecurryreis  
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Themenersteller
Beiträge: 2
Keratinozytenkultur klappt nicht

hallo liebe Leute,

ich bräuchte mal gebündeltes Schwarmwissen.
Ich bekomme bei der Isolation von Keratinozyten aus Mausschwanzgewebe kaum Zellen heraus und wollte mal fragen, ob jemand mit dem Problem schon mal zu tun hatte? Die Zellen sind dann so wenig, dass sie sich fürchten und nicht teilen.

Ich verwende ein Protokoll von pubmed mit Video dazu, dass eigentlich ganz vielversprechend aussieht. (keine Ahnung, ob ich es verlinken darf)
Die einzige Abweichung ist, dass wir den Schwanz vorher in Pen/Strep einlegen für 10 Min.

LG Marie
Mariecurryreis ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.10.2018, 10:57   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.483
AW: Keratinozytenkultur klappt nicht

Poste mal das Protokoll und den Link, sonst können wir hier nur kristallkugeln
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I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.10.2018, 11:18   #3   Druckbare Version zeigen
Mariecurryreis  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 2
AW: Keratinozytenkultur klappt nicht

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28745643

meine Überlegungen waren:

- zu alte Maus
- zu lange in Pen/Strep eingelegt, sodasss die Zellen Schaden genommen haben
- beim ausschütteln der Zellen war das Medium nicht wie beschrieben trübe, nur einzelne Klümpchen waren zu sehen.

ich komme echt nicht weiter.
Mariecurryreis ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 05.10.2018, 11:47   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.483
AW: Keratinozytenkultur klappt nicht

Zitat:
Zitat von Mariecurryreis Beitrag anzeigen
nur einzelne Klümpchen waren zu sehen.
War das PenStrep in PBS oder war da auch Futter (Glucose etc.) dabei? Das PenStrep am Anfang kannst du mE erstmal getrost weglassen. Wichtig ist, daß es dann im Kulturmedium ist und, noch wichtiger, die Kulturen täglich auf Kontamination untersucht werden (Mikroskop) und bei geringsten Anzeichen von Bakterien oder Pilzwachstum (ggf. weitere Antibiotics verwenden) gut mit sterilem PBS gespült und frisches Medium zugegeben wird.

Die Klümpchen deuten mE auf einen unzureichenden Verdau hin. Ginge alternativ zu Dispase auch Trypsin oder Collagenase?

Idealerweise läßt Du Dir die Technik von einer anderen AG (am besten an einer Uni in einer schönen Stadt in einem anderen Land, in dem gerade gutes Wetter ist ) zeigen, bei der das Routine ist. Das spart viel Geld, Zeit und Frust!
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imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 07.10.2018, 21:16   #5   Druckbare Version zeigen
Illumania weiblich 
Mitglied
Beiträge: 3
AW: Keratinozytenkultur klappt nicht

danke erstmal für den Post. die PenStrep Behandlung am Anfang würde ich dann einfach mal weglassen. Wenn das Spülen klappt bei einer Infektion probiere ich das im Zweifelsfall. Wir hatten leider Pilze und bakterielle Besiedlung davor, daher diese Vorsichtsmaßnahmen.

Einen alternativen Verdau zu versuchen wäre auch eine Möglichkeit.

Haha, bester Tipp aufjedenfall in sonnige Gefilde zu wechseln Nächste Woche könnte ich jemanden von einer anderen Arbeitsgruppe fragen, vielleicht ergibt sich noch eine zündende Idee.

Ist es denn so schwer Keras zu isolieren?
Illumania ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 09.10.2018, 08:31   #6   Druckbare Version zeigen
Thrips  
Mitglied
Beiträge: 61
AW: Keratinozytenkultur klappt nicht

Euer Protokoll ist schon ziemlich Standard, ich sehe nichts daran was die Kultur erschweren sollte.
Die Behandlung mit Pen/Strep vor der enzymatischen Trennung von Dermis und Epidermis ist sicher problematisch. Vorallem weil dann schon die innere Seite der Haut exponiert ist die 1. garnicht kontaminiert ein kann und 2. sehr empfindlich auf osmotische Veränderungen reagiert.
Besser Mauseschwanz vor der ganzen Behandlung ordentlich mit 70% Etanol oder auch einfach Sterillium (oder ähnlichem Handdesinfektionsmittel) gründlich abwischen und sterile Sektionsinstrumente verwenden. Die abgestorbenen Epithelzellen auf der Oberfläche nehmen Dir das nicht übel und die proliferierenden, tieferen Schichten bleiben verschont.
Falls es trotzdem Probleme gibt die Hautstücke vor dem Verdau für ein paar Minuten in Kulturmedium mit leicht erhöhter Konzentration von Pen/Strep und Amphotericin B, gegen Pilze, baden, bevor Du dann in die Enzymlösung überführst.
Beim Verdau ist wichtig, dass du das richtige Enzym verwendest, manche Chargen oder Marken funktionieren einfach nicht so gut wie andere, da dies meist Isolate sind die in ihrer Qualität trotz aller Beteuerungen nicht immer gleich gut sind. Ohne Werbung machen zu wollen, Worthington ist teuer aber vom Ergebnis in meinen Händen immer wieder überzeugend. Dein Protokoll verlangt allerdings Dispase, was sowieso ein Enzymmix unter einem Markenname ist.
Die Behandlung der Zellsuspension, der trüben Lösung nach dem Verdau verlangt etwas Fingerspitzengefühl, genug Turbulenz um die Zellen zu lösen, aber nicht zu viel um die empfindlichen Zellen nicht durch Scherkräfte in der Pipette zu zerstören.
Im Kulturmedium die Antibiotika und das Antimycotikum hoch halten, aber auch nicht übertreiben.
Nach dem Absitzen der Keratinozyten zügig das Medium wechseln um zu verhindern dass tote Zellen und deren Proteine (Differenzeirungsfaktoren, Apoptosesignale) wegzuwaschen.
Falls tatsächlich Hefen oder Pilze ein Problem sein sollten, Antimycotikum bist zu 14 Tage hoch halten bevor Du es absetzt, aber bedenken dass dies natürlich einen Effekt auf die Genexpression und das Verhalten der Zellen haben kann und deshalb Experimente erst nach dem Absetzen und einer Erholungszeit aussagefähing sind.
Ich arbeite zwar nurnoch mit Fibroblastenkulturen, aber von Wildtierbioopsien, selbst da gibt es bei sauberem Arbeiten nur selten Kontaminationen die man nicht in Griff bekommt.
Sind HaCaT Zellen (Petra Boukamp et al.) u.U. eine Alternative, deren Kultur ist recht einfach und in vielen Aspekten denen der primären Kreatinozyten ähnlich.
Thrips ist offline   Mit Zitat antworten
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keratinozyten, kultur

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