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Alt 19.09.2018, 22:33   #1   Druckbare Version zeigen
DestinyErased  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 9
cDNA herstellen, Schritte im Labor?

Hallo,

ich habe eine eher praktische als theoretisch Frage zum Thema cDNA herstellen. Und zwar wie genau macht man das im Labor von Anfang bis Ende?

Damit meine ich die einzelnen Arbeitsschritte, z.B. Ausgangspunkt ist eine einzelsträngige RNA und daraus soll eine cDNA erstellt werden und mir fehlt zum Beispiel der Übergang von: Primer zugeben -> PCR -> und dann was?
Ich würde tippen eine Gelelektrophorese (das haben wir zumindest immer im Praktikum gemacht und das war's dann auch, danach kam nix weiter), aber wie kriege ich dann die cDNA aus dem Gel und wie kann ich die cDNA weiter verwenden danach?
Das verstehe ich nicht so ganz.

Daher meine Frage, ob vielleicht jemand aus der Praxis mir die einzelnen Arbeitsschritte (mit Übergang) auflisten kann?

Gruß und Danke im voraus
DestinyErased ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 20.09.2018, 07:00   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.483
AW: cDNA herstellen, Schritte im Labor?

https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-preparation/reverse-transcription-cdna-synthesis
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 20.09.2018, 18:44   #3   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.616
AW: cDNA herstellen, Schritte im Labor?

Im einfachsten Fall isolierst du Gesamt-RNA über Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit einem Kit (Isolierung von mRNA ist i.d.R. nicht nötig).
Dann nimmst du eine definierte Menge, z.B. 1 µg Gesamt-RNA, gibst Puffer, dNTPs und Primer (oligo-dT-Primer, ggf. auch Random-Hexamers) zu. Oft erhitzt man das Gemisch dann kurz und kühlt ab, damit die Primer sich gut anlagern können. Dann gibst du die Reverse Transkriptase zu und inkubierst bei einer festen Temperatur (keine Zyklen wie bei einer PCR!). Anschließend kannst du ein bisschen RNase H zugeben, um die RNA abzubauen und die einzelsträngige DNA zu behalten. Dabei hast du dann ein wildes Gemisch von allen möglichen einzelsträngigen cDNAs in der Lösung.

Anschließend kannst du dieses cDNA-Gemisch als template für eine PCR verwenden, um spezifisch die gewünschte cDNA für dein Genprodukt zu amplifizieren. Das PCR-Gemisch kannst du dann tatsächlich auf ein Agarose-Gel geben, nach dem Laufen die gewünschte Bande ausschneiden und daraus die DNA extrahieren (Gelextraktion).
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 20.09.2018, 20:27   #4   Druckbare Version zeigen
DestinyErased  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 9
AW: cDNA herstellen, Schritte im Labor?

Oh vielen Dank euch Beiden, das hilft mir auf jeden Fall. Kann mir jetzt schon eher was darunter vorstellen wie das nun in der Praxis läuft. Danke
DestinyErased ist offline   Mit Zitat antworten
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