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Alt 03.11.2018, 15:53   #1   Druckbare Version zeigen
Darquesse  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 1
PCR Ansatz bzw. Mastermix berechnen

Hallo erstmal ,

starte nächste Woche in ein Labor und lese mir grade die Angaben durch und ich blick das mit dem Mastermix nicht mehr. Habe folgende Angabe:
Gesamtvolumen pro Ansatz: 25mykroL
2mM dNTPs (2,5mykroL)
12,5pmol fw primer (2,5mykroL 5pmol/mykroL)
12,5 pmol rv primer (2,5mykroL 5pmol/mykroL)
0,5 U phusion pol ( 1mykroL 0,5 U/L)
0,5 ng plasmid Dna (2mykroL 250 pg/mykroL)
h2o auf 25 mykroL.



Rechne ich nun die angaben in der Klammer mit der ersten Angabe per schlussrechnung.. sprich 6,25 mykrol. fw primer auf 25 MykroL Ansatz?
Und beim Mastermix ist auch eine Angabe: Pro Ansatz die entsprechende Menge (für einen Ansatz von 25 mykroL) in einem Vol von 18 MykroL. wie komme ich auf die 18 mykroL?
Darquesse ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 04.11.2018, 20:46   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.622
AW: PCR Ansatz bzw. Mastermix berechnen

Willkommen hier.

Rechnen musst du da eigentlich kaum noch was. Du gibst für eine Reaktion folgendes zusammen:

2.5 µl der 2 mM dNTPs
2.5 µl des Fw-Primers, der eine Konzentration von 5 pmol/µl hat, also insgesamt 12.5 p mol.
2.5 µl des Rev-Primers, der eine Konzentration von 5 pmol/µl hat, also insgesamt 12.5 p mol.
1 µl der Phusion Polymerase, die eine Konz. von 0.5 U/µl hat , also insgesamt 0.5 U.
2 µl Plasmid DNA, die eine Konz. von 250 pg/µl hat, also 500 pg bzw. 0.5 ng.
Es wird Wasser bis auf ein Volumen von 25 µl benötigt, also: 14.5 µl.

Praktisch würdest du zunächst das Wasser pipettieren und dann alle anderen Komponenten hinzugeben.

Jetzt sollst du ja nicht eine Reaktion machen, sondern einen Mastermix für mehrere Reaktionen. Die Frage ist hier, was genau gemacht werden soll.

Wenn immer wieder die gleiche Reaktion durchgeführt werden soll, nur mit anderer DNA, dann gibst du alle Komponenten außer der DNA zusammen, das wären pro Reaktion 25 µl - 2 µl = 23 µl.

Manchmal will man aber unterschiedliche DNA-Proben und unterschiedliche Primer verwenden, alles andere bliebe gleich, dann würdest du pro Reaktion kommen auf: 25 µl - 2 µl (DNA) - 2.5 µl (Fw Primer) - 2.5 µl (Rev Primer) = 18 µl.


Angenommen, du hättest 5 DNA-Proben, die Primer blieben gleich. Dann könntest du folgenden Mastermix ansetzten:
dNTPs: 5 x 2.5 µl = 12.5 µl
Fw Primer: 5 x 2.5 µl = 12.5 µl
Rev-Primer: 5 x 2.5 µl = 12.5 µl
Phusion: 5 x 1 µl =5 µl
Wasser: 5 x 14.5 µl = 72.5 µl

Von diesem Mastermix würdest du dann 23 µl für jede Reaktion einsetzen und 2 µl der jeweiligen DNA-Probe zugeben.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
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pcr mastermix volumen

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