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Alt 25.08.2009, 10:29   #1   Druckbare Version zeigen
David123  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 8
Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

Hallo zusammen!

Ich stehe vor einer kleinen Aufgabe.
Und zwar möchte ich die Oligomerisation von einem bestimmten Peptid nachweisen.
Es gibt zwar einige gute Methoden was ich weiß, wie zb Glycerolgradient, western Blot etc, aber diese Methoden sind mir zu semiquantitativ.
Habe mir überlegt ob das ganze nicht mit FMOC oder so funktionieren könnte.
Sprich, je größer das signal, desto mehr peptide sind oligomerisiert.
Es wär recht wichtig, da dieses ding scheinbar im physiologischen Milieu (meine süßen ratties *g*) sich sehr heterogen verhaltet und ich vermute, dass es an einer dimerisierung der peptide liegt.

nur wäre es sicherlich besser, würde ich vorher die genaue struktur des peptides kennen bevor ich es appliziere.
was meint ihr? kann man mit hplc das gut nachweisen? proteine lassen sich immerhin sehr gut auf rp-säulen trennen. fmoc sollte theoretisch auch gut binden.

habt ihr bessere vorschläge vll?

vieln dank vorerst

mfg
David123 ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 27.08.2009, 15:27   #2   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.723
AW: Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

Wir hatten mal einen Master-Studenten mit eine Fragestellung, wo es ebenfalls um die Bildung von Dimeren bzw. Oligomeren ging, allerdings von Proteinen.
Sowas kann man mittels Gelchromatographie machen und zwar nicht nur an einer FPLC, sondern auch an einer HPLC-Anlage, wenn man eine passende Säule hat.

Auch wenn ich nicht weiß, wie groß Deine Peptide wirklich sind und welche Eigenschaften sie haben, würde ich daher mal behaupten, dass Du eine Oligomerisierung mit Gelchromatographie an einer HPLC nachweisen kannst.

Wenn Du Tryptophanreste in Deinem Peptid hast, könnte man vielleicht auch einfach was mit Fluoreszenzspektroskopie machen. Das Fluoreszenzmaximum ändert sich ja in abhängigkeit davon, wie hydrophil bzw. hydrophob die Umgebung ist. Gleichzeitig hast Du ja bei der Oligomerisierung ein Gleichgewicht, was von der Konzentration des Peptides abhängig ist. Daher könnte man vielleicht über die Lage des Tryptophan-Fluoreszenz-Maximums bei unterschiedlichen Konzentrationen eine Aussage über die Oligomerisierung machen.

Wie und was Du mit dem FMOC zeigen willst, ist mir übrigens nicht ganz klar geworden...
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 28.08.2009, 15:03   #3   Druckbare Version zeigen
David123  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 8
AW: Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

hmm...ja...fluoreszenssektroskopie würde theoretisch auch gehn. stimmt sogar...vermutlich auch recht einfach. wenn man genügend zeit hat ein assay zu erstellen.

bezüglich des fmoc-cl:
fmoc-cl ist doch ein reagenz das mit der aminogruppe eine gute bindung eingeht. ich dachte mir einfach die proteine (monomer sollte nicht größer als 15kDa sein vermutlich) mit einer C18 Säule trennt, nachdem man sie mit fmoc-Cl derivatisiert hat. anschließend einfach abspalten und anhand der signalintensität (fluoreszens bzw diodenarray) sollte ich doch auf die struktur dieser dinger rückschließen können, oder?

ich hoffe du kannst meine wirren gedankengänge folgen *gg*

mfg
David123 ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 28.08.2009, 16:11   #4   Druckbare Version zeigen
zarathustra  
Moderator
Beiträge: 11.723
AW: Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

Bei 15 kDa hast Du ein Makromolekül aus grob 150 Aminosäuren, da kann man schon gut von einem Protein sprechen.

Zitat:
Zitat von David123 Beitrag anzeigen
hmm...ja...fluoreszenssektroskopie würde theoretisch auch gehn. stimmt sogar...vermutlich auch recht einfach. wenn man genügend zeit hat ein assay zu erstellen.
Ich würde ganz einfach ein Fluoreszenzspektrum der Lösung Deines Proteins messen, verdünnen, messen, verdünnen usw. Wenn das klappt gehört da kein großer Assay zu.

Zitat:
Zitat von David123 Beitrag anzeigen
bezüglich des fmoc-cl:
fmoc-cl ist doch ein reagenz das mit der aminogruppe eine gute bindung eingeht. ich dachte mir einfach die proteine (monomer sollte nicht größer als 15kDa sein vermutlich) mit einer C18 Säule trennt, nachdem man sie mit fmoc-Cl derivatisiert hat. anschließend einfach abspalten und anhand der signalintensität (fluoreszens bzw diodenarray) sollte ich doch auf die struktur dieser dinger rückschließen können, oder?
Wenn ich das richtig verstanden habe, dann möchtest Du doch die Interaktion des Proteins mit anderen Molekülen des selben Proteins untersuchen. UNd zwar nicht-kovalente Wechselwirkungen. Ich kenne zwar die Derivatisierung mit FMOC, aber der Einbau von FMOC unterschiedlich sein, wenn Du eine Interaktion mit anderen Protein-Molekülen hast? Gehst Du davon aus, dass durch Interaktion einzelne Lysin-Seitenketten "verborgen" sind und dadurch nicht derivatisiert werden können?

Bei der Größe Deines Proteins müsste Gelchromatographie die beste Methode sein. Im Zweifelsfall kannst Du das dann auch an einer FPLC machen und die Absorption bei 220 nm oder 280 nm messen.
__________________
Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
zarathustra ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 31.08.2009, 19:54   #5   Druckbare Version zeigen
David123  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 8
AW: Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

jo...protein...mein i ja eh

also ich wollte eigentlich die proteine zuerst entfalten und dann derivatisieren um sicher zu stellen dass auch alle basischen seitenketten mit fmoc gekoppelt sind, bin dann aber selber über den gedanken gestolpert weil ich ja dann die oligomerisierung nimma nachweisen könnte *g*

also idee ist bäh

ich werd mich mal denk ich bissi mit der fplc beschäftigen. da ich ohnehin die proteine damit aufreinige, gach findet sich ja noch ne lösung?

aber danke vorerst für die vorschläge (oft is der einfachste weg eh der beste )

mfg
David123 ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 31.08.2009, 22:03   #6   Druckbare Version zeigen
DeFianT Männlich
Mitglied
Beiträge: 409
AW: Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

Mit Größenausschluss FPLC geht sowas super. Wenn dein Protein bereits sauber ist (reicht wohl sowas wie >80-90%) und deine Säule geschickt gewählt, kannst du Multimere recht deutlich voneinander trennen!

Denke sogar, dass du das mit ner Batch-Säule hinbekommst, wenn du genug Protein hast.
__________________
Concepts change, Facts don't!
DeFianT ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 03.09.2009, 22:46   #7   Druckbare Version zeigen
David123  
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 8
AW: Mit HPLC die Oligomerisation von Peptiden nachweisen? Methoden gesucht!

jo cool
haut hin

danke
David123 ist offline   Mit Zitat antworten
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Stichworte
hplc, oligopeptid, protein, schutzgruppen

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