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Archiv verlassen und diese Seite im Standarddesign anzeigen : Trennung von Milchproteinen mit Elektrophorese


Milka25
13.03.2002, 20:05
Hallo Leute!

Wir wollen in unserem Projekt die Proteine von Tiermilchen und Humanmilch mit Hilfe der Elektrophorese trennen.

Nun suche ich nach einer geeigenten Vorschrift, wie wir das am Besten machen könnten.

Ich habe es auch schon mit diversen Suchmaschinen probiert, habe aber nichts geeignetes gefunden.

Vielleicht habt ihr ja noch ein paar Tipps für mich!

Schonmal Danke für eure Hilfe!

Milka

ehemaliges Mitglied
14.03.2002, 08:58
Hallo erst mal,

Elektrophorese ist eigentlich recht einfach.
Vorausgesetzt man hat eine Elektrophoreseapparatur. :rolleyes:
Zuerst mußt Du ein Agarosegel gießen. Eine Konzentration von 2 % bis 4 % müßte ausreichen.
Wenn das Gel erstarrt ist einfach die Proteine mit einem geeigneten Ladepuffer auftragen und Spannung anlegen. Wichtig dabei ist, daß die Spannung nicht zu hoch ist. Sonst erwärmt sich der Laufpuffer zu stark und das Gel kann an den Rändern zu schmelzen beginnen.

genaueres gibts

Hier (http://www.bioproducts.com/technical/proteinelectrophoresisinagarosegels.shtml)

ehemaliges Mitglied
15.03.2002, 16:59
Ich empfehle mal 4 % Agarose, denn Proteine >200 kDa dürften für dieses Beispiel sicher nicht in Frage kommen. Wenn's machbar ist, würde ich aber doch lieber auf Polyacrylamid-Gele zurückgreifen. Keine Ahnung, ob die Trennleistung der Agarose-Geschichte ausreichen würde, um signifikante Unterschiede der einzelnen Milchsorten zu zeigen.
Aber mal ne Frage: Warum will alle Welt mit Humanmilch rumspielen? Gibt's da besonders billige Bezugsquellen oder was? Vor einiger Zeit wolle hier jemand Immunglobuline aus Muttermilch isolieren...

Penthesilea
15.03.2002, 18:34
Stelle ich mir an und für sich interessant vor, Ig aus Muttermilch zu isolieren....wenn es nicht schon überall stünde, wieviel drin ist. Aber gibt es eigentlich Vergleiche der Ig-Konzentrationen in der Muttermilch bei unterschiedlichen Säugerarten?
Mich wundert nämlich, daß kleine Katzen nie erkältet zu sein scheinen, Menschenkinder dagegen oft (denke da an meine eigene Kindheit).

P.

Milka25
15.03.2002, 19:55
@Nitropenta
Ich beschäftige mich schon seit über einem Jahr mit der Humanmilch.
Das Hauptthema dabei ist, die isolierten Frauenmilcholigosaccharide zu Anlysieren, und herrauszufinden aus welchen Monosacchariden sie bestehen.

Und nun sind in unserem Projekt die Proteine dran. Die Ergebnisse, die wir hoffentlich erhalten werden, werden dann mit denen von den Tiermilchen (Kuhmilch und Stutenmilch) verglichen.

Milka

ehemaliges Mitglied
15.03.2002, 20:07
In welchem Rahmen läuft denn dieses Projekt? Wenn's mehr als ein Schuß ins Blaue sein soll (was ich einfach mal stark annehme), würde ich von der Agarose-Geschichte abraten. Was soll denn nach der Auftrennung passieren? Ich meine, ein paar Banden auf dem Gel sind ja nett, aber man muß sie ja auch identifizieren. Das ungefähre Molekulargewicht hilft einem sicher nicht allzu viel...
Neugierig wie ich bin: Wie habt Ihr denn die Oligosaccharide analysiert? Ist ja alles andere als trivial...

Milka25
15.03.2002, 20:24
@Nitropenta

Die Analyse der Oligosaccharide habe ich während meines berufspraktischen Semesters gemacht. Dazu werden die Oligosaccharide hydrolysiert und anschließend derivatisiert.Und zu guter letzt wird noch eine HPLC-Analyse ausgeführt.

Die Sache mit den Proteinen ist ein studentisches Projekt,und könnte tatsächlich, wie du schon gesagt hast, ein Schuß ins Blaue werden.
Die Proteine sollen sicherlich identifiziert werden, wenn wir was brauchbares zustande bekommen haben. Aber dafür muss halt auch erstmal die Elektrophorese in Gang gebracht werden und auch eine geeignete Methode dafür gefunden werden, was sicherlich auch nicht so einfach sein wird. Mal sehen was dabei rauskommt.


Milka

ehemaliges Mitglied
17.03.2002, 18:42
Also dann SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese! Danach je nach Verfügbarkeit Western Blot (Nachweis durch Antikörper) oder Silberfärbung, Banden ausschneiden und Massenspektrometrie davon. Kein schlechtes Programm... Oder schieße ich jetzt über's Ziel hinaus?

ehemaliges Mitglied
18.03.2002, 08:32
@ Nitropenta

Polyacrylamidgele haben zwar eine gute Trennleistung sind aber von der Handhabung für ungeübte nicht gerade einfach. Zum Einen sind die Ausgangssubstanzen ziemlich ungesund und zum Andern zerreißt das Gel sehr leicht.

Im übrigen gibt es Agarosen, die nahezu an die Trennleistung von PAG rankommen. Agarosegele sind leichter zu handhaben und ungefährlich. ;)

ehemaliges Mitglied
18.03.2002, 11:29
@PCRManiac:
Wenn ich mir ansehe, daß schon mal Oligosaccharide hydrolysiert, die Monosaccharide derivatisiert (silanisiert?) und per HPLC analysiert wurden, frage ich mich, warum man bei - zumal recht kleinen! - Proteinen plötzlich mit Agarose anfangen sollte. Gibt's die eigentlich auch als dünne Gele, mit denen man noch was anfangen kann (z.B. blotten)?. Außerdem müssen Studenten sowieso irgendwann lernen, sicher mit ungesunden Sachen rumzupanschen. Und daß das Gel leicht zerreißt, stimmt auch nicht (na ok, je nach Acrylamid-Konzentration, aber bei den recht kleinen Proteinen mache ich mir da wenig Sorgen). Man darf nur nicht mit trockenen Handschuhen dranlangen...

ehemaliges Mitglied
19.03.2002, 08:46
@ Nitropenta

Agarosegele kann man auch dünn gießen. :p
Es kommt natürlich darauf an, was Du für eine Agarose hast und für welchen Zweck Du das Gel brauchst bzw welche Volumina an Probe Du auftragen möchtest. Ich benutze in der Regel Gele mit einer Stärke von 3 bis 4 mm. Die kann man übrigens wunderbar im Geltrockner trocknen ohne das sie die Größe verändern und irgendwie brüchig werden.
Autoradiographie ist mit diesen Gelen möglich.

Ich bin halt ein Agarose Fan, da die Gele leichter zu handhaben sind und die Ausgangssubstanzen nicht so ungesund sind. :)

ehemaliges Mitglied
19.03.2002, 11:55
@PCRManiac:
Mein Standpunkt ist, daß Agarose was für DNA-Fetischisten ist :D . Bin halt Polyacrylamid- und Protein-Fan. Aber mal ernsthaft: Welche Proteingrößen trennst Du denn damit auf?

ehemaliges Mitglied
19.03.2002, 16:23
@ Nitropenta
Momentan eigentlich nur DNA. Ich untersuche wie bestimmte Gene gespleißt werden.

Die entsprechenden Proteine kommen noch.

ehemaliges Mitglied
20.03.2002, 11:36
@PCRManiac:
Entschuldigung, aber Du propagierst eine Methode (Agarosegele für Proteine), mit der Du selbst überhaupt keine Erfahrungen hast, und lehnst eine andere - etablierte - ab mit der Begründung, sie sei nicht so angenehm? Ich hatte gehofft, daß etwas mehr dahintersteckt als nur ein Link ins Netz (siehe oben).
Sollen die von Dir zu untersuchenden Proteine wirklich per Agarosegel analysiert werden (nativ oder denaturierend)? Nehmen wir mal a-Lactalbumin (sollte in Milch wohl zu finden sein; interessiert Dich zwar nicht, aber paßt zum Thread) mit 14,2 kDa. Das entspricht ca. 130 Aminosäureresten (ca. 110 Da/AS) oder (mindestens) 390 Basenpaaren (cDNA), was sich auf Agarosegelen ganz gut darstellen läßt. Verglichen dazu sind die 14,2 kDa des Proteins geradezu kümmerlich - das entspräche direkt umgerechnet (ca. 660 Da pro Basenpaar) nur 22 Basenpaaren, und die möchte ich lieber nicht auf einem Agarosegel sehen. Ich weiß, daß man so ein bißchen Äpfel mit Birnen vergleicht, aber ich wollte klarmachen, daß es hier um völlig verschiedene Größenordnungen geht. Die a-Lactalbumin-cDNA hat ein Molekulargewicht von >257 kDa, also etwa das 20fache des Proteins!

ehemaliges Mitglied
20.03.2002, 14:58
@ Nitropenta

Ich habe zwar noch keine Erfahrungen was die Proteine betrifft :confused:
aber warum sollte es nicht funktionieren? FMC bietet warscheinlich nicht umsonst spezielle Agarosen zur Proteinbestimmung an. :o
Bei den Größenordungen stimme ich Dir völlig zu.
Bei 22 Basenpaaren brauchst Du gute Augen. :)
Ich werde es jedenfalls testen. Sobald ich Ergebnisse habe kann ich sie ja mal posten

ehemaliges Mitglied
20.03.2002, 19:22
@PCRManiac:
Ich will ja gar nicht bezweifeln, daß Agarosegele für bestimmte Proteine (nämlich SEHR große) brauchbar bzw. das Mittel der Wahl sein können. Aber für die üblichen Größen (die auch in Milch vertreten sein dürften) halte ich sie für nicht geeignet.

Milka25
04.06.2002, 19:42
Hallo Leute!

Nachdem fast 3 Monate vergangen sind, möchte ich mal den Stand der Dinge durchgeben.

Wir haben uns für die SDS–Elektrophorese entschieden.
Zuerst haben wir versucht ein Gel selbst zu gießen, was aber nicht geklappt hat.
Da hätte ich auch gleich mal einige Fragen. Beim Gelgießen wird ja Ammoniumperoxodisulfat (APS) verwendet. Nach meinen Informationen dient dies der Radikalbildung, simmt das? Außerdem verwendet man
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED). Welche Aufgabe oder Funktion hat das TEMED?

Nachdem Chaos mit dem Gelgießen sind wir auf Fertiggele umgestiegen. Ist ja doch wesentlich einfacher.
Nur haben wir jetzt so ein paar Probleme mit dem Power Supplyer.
Wir haben folgende Einstellung angewendet:
200 V
60 mA
15 W
Nur ist dabei noch nichts brauchbares rausgekommen. Habt ihr vielleicht noch andere Erfahrungswerte diesbezüglich?

Danke schonmal für eure Hilfe

Milka

ehemaliges Mitglied
04.06.2002, 20:14
TEMED dient der Radikalstabilisierung. SDS-Polyacrylamidgele zu gießen ist nicht sooo schwer. Woran hakt's denn genau? Aber bitte vorsicht, Acrylamid ist giftig!
Nun zu Euren Einstellungen: Die genauen Werte hängen von den Abmessungen des Gels ab. Wir benutzen im Labor meist Gele 140 mm x 120 mm x 1 mm. Diese laufen bei konstant 35 mA, die Spannung steigt im Laufe der Zeit von knapp 100 V auf über 200 V. Die 15 W, die Ihr eingestellt habt, haben keine Auswirkungen, denn 200 V x 0,06 A = 12 W < 15 W. 60 mA sind vermutlich zu viel für Eure Gele. Was ist denn eigentlich genau passiert? Du schreibst nur, daß nichts Brauchbares herausgekommen sei. Habt Ihr eine diskontinuierliche Elektrophorese (also mit Sammelgel) benutzt? Und was habt Ihr mit dem Gel gemacht? Coomassie-Färbung?

Milka25
04.06.2002, 22:36
@ Nitropenta
Stimmt das Gel zu gießen ist nicht schwer, aber das SDS-Set, was wir verwendet haben war zu alt. Ist halt vor ein paar Jahre gekauft worden, wurde aber nie verwendet. Deshalb gehen wir davon aus, dass es daran liegen könnte, das die Gele nicht fest geworden sind.
Wir arbeiten natürlich mit Handschuhen und unter dem Abzug!

Also wir haben diese Minigele, 70 mm x 80 mm x 1 mm, mit 10% Trenngel und 4% Sammelgel.

Eine Trennung haben wir bis jetzt noch nicht erreicht, da der Power Supplyer noch nicht so richtig funktioniert. Und wir waren uns noch nicht so richtig sicher, welcher Parameter konstant gehalten werden soll. Aus einer Vorschrift geht hervor, dass die Voltzahl konstant sein soll und aus der anderen das die Amperzahl konstant sein soll.

Wenn die die Trennung endlich funktioniert wird eine Coomassie-Färbung durchgeführt.

Danke für deine Hilfe

Milka

ehemaliges Mitglied
05.06.2002, 10:30
Daß Gele nicht auspolymerisieren, sollte normalerweise daran liegen, daß das Ammoniumpersulfat zu lange als wäßrige Lösung gelagert wurde und sich zersetzt hat. Sauerstoff verlangsamt den Prozess übrigens auch, aber das sollte eigentlich kein Problem darstellen. Man sieht halt, daß es da, wo Luft unmittelbar drankommt, nicht richtig polymerisiert.
Ob man nun Spannung oder Strom konstant hält, ist wohl Geschmackssache (oder Laborräson). In jedem Fall würde ich einem Minigel keine 12 W zumuten wollen, es sei denn, man möchte das Gel kochen. Probiert's mal mit 25 mA und von mir aus 200 V als Eckwerten; die 200 V werdet Ihr bei diesen Einstellungen vermutlich gar nicht erreichen.
Mixt Ihr den Auftragspuffer selbst oder wurde der auch mitgeliefert? Den Laufpuffer macht Ihr wohl selbst. Wenn's gewünscht wird, kann ich mir die Rezepte auch mal ansehen (bitte dann per PN oder E-Mail). Wenn's mal klappt, kann man auch noch optimieren, indem man z.B. 12 oder 14 % Acrylamid ausprobiert. Aber was meinst Du mit:
Wenn die die Trennung endlich funktioniert wird eine Coomassie-Färbung durchgeführt. ?
Wie testet Ihr denn sonst im Moment das Ergebnis der Trennung?

Milka25
05.06.2002, 22:11
Das APS lag als Feststoff vor und die Lösung wurde immer frisch angesetzt. Die ganze Trenngel-Lösung wurde immer mit einer Wasserstrahlpumpe entgast.


Wenn der Auftragspuffer gleich dem Inkubationspuffer ist, dann wurde er mitgeliefert.

Der Laufpuffer wurde auch mitgeliefert. Er ist allerdings 10fach konzentriert. Wir haben den Laufpuffer 1:10 verdünnt. Kann es vielleicht auch sein, das der Laufpuffer zu dünn ist oder spielt das keine Rolle?

Habe ich das richtig verstanden: ich stelle also am Power Supplyer 200 V und 25 mA ein und startet dann den Elektrophoreselauf

Da der Inkubationspuffer mit Bromphenolblau versetzt ist, kann ich ja anhand der Blaufärbung sehen, ob die Proteine wandern oder nicht. Und im unserem Fall ist nach anlegen der Spannung nichts gewandert.


Milka

ehemaliges Mitglied
06.06.2002, 18:47
APS-Lösung kann man einfrieren, dann hält sie länger. Das Entgasen ist für diesen Zweck gar nicht nötig, schadet aber sicher nicht. Die fertige Gel-Mischung (natürlich ohne APS/TEMED) kann man im Kühlschrank wochenlang lagern.
Der Auftragspuffer ist vermutlich identisch mit dem "Inkubationspuffer" (blau und stinkt). Der Laufpuffer sollte ok sein, 1:10 verdünnen habt Ihr sicherlich korrekt hinbekommen ;) . Wenn dessen Konzentration arg daneben liegt, gibt es Probleme, aber das nehme ich in Eurem Fall nicht an. Irgendwas müßte man dann immer noch sehen.
Nun zum Netzteil (neudeutsch "power supply" :mad: ): Ihr stellt 200 V und 25 mA ein, wobei der Strom in diesem Fall limitierend sein sollte. Zu Anfang sollte die Spannung vielleicht um die 80 V liegen (das ist nur eine Schätzung) und dann langsam ansteigen. Ihr könnt auch probehalber mal 80 V und 50 mA einstellen und schauen, wieviel Strom tatsächlich fließt (hier sollte die Spannung limitierend sein). Wenn der Strom 50 mA beträgt, stimmt irgendetwas vermutlich nicht (ebenso bei 0 mA :rolleyes: ). Bilden sich denn an den Elektroden Bläschen? Ein bißchen sollte man eigentlich sehen können. Irgendwie habe ich den Eindruck, daß gar kein Strom fließt, denn das Bromphenolblau muß sich einfach bewegen. Im Zweifel mal mit einem Meßgerät Eures Vertrauens nachmessen, ob die eingestellten Werte auch wirklich in der Gelapparatur ankommen...

Milka25
06.06.2002, 19:24
Also an den Elektroden haben sich Bläschen gebildet, das konnte man sehr gut erkennen.

Wir gehen davon aus, dass das SDS in den jeweiligen Puffern enthalten ist, sind uns aber nicht sicher.
Wäre es ein Fehler, wenn wir zusätzlich noch SDS zufügen würden?


Wir werden nächste Woche nochmal ein Gel laufen lassen, mit den Einstellungen die du mir genannt hast, mal schauen was dabei rauskommt. Ich werde es auf alle Fälle berichten.

Noch eine Frage. Kann es auch sein, dass der Auftragspuffer zu alt ist und deswegen nichts funktioniert?

Milka

ehemaliges Mitglied
06.06.2002, 21:15
Schaden würde 0,1 % SDS im Gel zusätzlich vermutlich nicht. Es sollte aber eigentlich angegeben sein, ob es im Puffer drin ist oder nicht, bzw. im Rezept separat aufgeführt sein. Aber Ihr nehmt ja jetzt ohnehin Fertig-Gele.
Das einzige, was am Auftragspuffer "altern" kann, ist der ß-Mercaptoethanol (ß-ME). Dann werden Disulfidbrücken in den Proteinen nicht mehr reduziert und das Trennergebnis sieht anders aus. Solange es ordentlich stinkt, ist aber alles ok. Evtl. ist auch statt ß-ME Dithiothreitol (DTT) drin. Das stinkt anders und nicht so stark, erfüllt aber den gleichen Zweck (ist auch weniger giftig und wesentlich teurer). Die Proteine müssen mit Auftragspuffer vor dem Beladen des Gels ca. 2 min auf etwa 95 °C erhitzt werden (Denaturierung). Das Bromphenolblau muß aber in jedem Fall wandern, egal was Ihr den Proteinen antut bzw. nicht antut. Ihr solltet auch in jedem Fall überprüfen, daß der Laufpuffer Kontakt zum Gel behält; manchmal sind die Elektrophoresekammern etwas undicht und der Flüssigkeitsspiegel sinkt schnell ab, so daß die Oberkante des Gels kaum noch Kontakt zum Puffer hat. Kurzschlüsse zwischen oberem und unterem Pufferreservoir verhindern natürlich auch wirkungsvoll ein positives Ergebnis :D . Also vielleicht das untere Reservoir nicht knallvoll schütten, sondern nur bis das Gel ca. 1 cm eintaucht.

Milka25
07.06.2002, 00:23
Das die Pufferkammern nicht so richtig dicht sind, ist uns auch schon aufgefallen :D . Aber das sollte keine Problem diese richtig dicht zu bekommen. Man muss es halt nur richtig zusammenbauen :) .

Ansonsten haben wir alles so durchgeführt wie du es beschrieben hast. Wir haben die Proben ca. 2 Minuten bei 100°C erhitzt und die untere Pufferkammer so befüllt, dass das Gel etwa 1 cm eintaucht.

Schauen mer mal was nächste Woche so alles passiert!

Milka

ehemaliges Mitglied
07.06.2002, 12:36
@Nitropenta
Ich muß erstmal zugeben, daß meine Agarosegeschichte nicht so richtig hingehauen hat.
Anfangs sah es ganz gut aus aber wie Du schon gesagt hast landen die kleinen Proteine alle im Laufpuffer und sind nicht mehr zu sehen.

@ Milka25
Falls Du mal eine gute Quelle für Pufferrezepte brauchst gibt es bei Qiagen einen Benchguide zum download. Dort sind alle gängigen Puffer und Lösungen sowie Methoden beschrieben.

zum Benchguide (http://www.qiagen.com/literature/BenchGuide/BenchGuidelit.asp)

Milka25
07.06.2002, 19:35
@ PCRManiac

Danke für deinen Tip mit den Pufferrezepten. Kann man immer mal gebrauchen.

Milka

Milka25
14.06.2002, 19:25
So da bin ich wieder :).
Und was soll ich sagen, das erste Ergebnis ist da :).
Diesesmal hat die Elektrophorese funktioniert. Die Trennung der Banden ist zwar noch nicht optimal, aber es war ja auch erst der erste Versuch.

Mir ist nach dem Starten der Elektrophorese aufgefallen, dass sich eine "scharfe" Linie aus Bromphenolblau gebildet hat.
Zuerst ist es ja so, dass die aufgetragenen Proben durch die Taschen getrennt sind und mit dem Starten der Elektrophorese bildete sich diese Linie. Entsteht die Linie durch Diffusion des Bromphenolblau?

Das die Trennung nicht so optimal war, könnte doch daran liegen, dass zuviel Probenmaterial (15 µL) aufgetagen wurde oder? Wieviel Probenmaterial gibst du in die Taschen?

Außerdem glaube ich, dass die Elektrophorese zu schnell lief und somit die Trennung nicht so gut war. Wir haben den Lauf nach 37 min abgebrochen, da die Bromphenolblaufront schon sehr weit unten war. Ich muss dazu sagen wir haben das Elektrophorese mit 200 V und 60 mA (limitierend) laufen lassen. (Aber das Gel hat nicht gekocht ;) )

Und noch eine Frage, wie kann man das gefärbte Gel am besten Aufbewaren?

Milka

ehemaliges Mitglied
14.06.2002, 20:29
Was war denn diesmal anders?
Ja, Bromphenolblau ist ein recht kleines Molekül, das aber im Gel so schnell läuft wie sehr kleine Proteine (die von der Molmasse deutlich darüber liegen), weil es nicht stark geladen ist. Durch seitliche Diffusion vereinigen sich die Bromphenolblau-Banden der einzelnen Taschen sehr schnell zu einer Linie. Wenn man nach dem Probenauftrag noch längere Zeit wartet, sieht man sehr schön, wie das Bromphenolblau schon in das Sammelgel diffundiert. Die Proteine sind aber immer noch in der Geltasche zu finden!
Das Volumen des Probenmaterials spielt keine Rolle, solange es in die Geltasche paßt. Wichtig ist die gesamte Proteinmenge: Mehr als 100 µg einer bunten Proteinmischung würde ich hier auf keinen Fall auftragen. Da bei Milch nur relativ wenige Proteine drin sind, würde ich eher noch weniger nehmen. Als Versuch könntet Ihr ja verschiedene Proteinmengen ausprobieren. Habt Ihr eigentlich einen Größenmarker mit dabei?
Nochmal meine Frage: Warum dreht Ihr den Strom so hoch? Habt Ihr es eilig (nur eine Doppelstunde zur Verfügung ;) )? Zu Anfang dürfte der Strom zu hoch sein; gegen Ende des Laufes sind allerdings vermutlich die 200 V limitierend. Für ein Minigel reichen 25 mA dicke, bei zwei Gelen in einer Gelkammer eben 50 mA.
Thema Konservierung der Gele: Man trocknet sie im allgemeinen. Dazu gibt es zwei Methoden:
1. Gel zwischen zwei feuchte Zellophanfolien legen, in einen Trockenrahmen einspannen und stehen lassen.
2. Gel auf ein dickes mit Entfärber getränktes Filterpapier legen, Frischhaltefolie auf die Oberseite (damit das Gel nirgendwo anders festklebt) und 1 h unter Vakuum bei 60-70 °C in einer speziellen Apparatur trocknen.
Falls das alles nicht so ganz das Richtige für Euch ist: Scannt das Gel einfach ein.

Milka25
19.06.2002, 19:54
So da bin ich wieder!

Heute aber wir erneut ein Gel laufen lassen. WIr haben das Gel zunächst mit 40 mA laufen lassen und haben nach ca. 50 min auf 50 mA erhöht. Denn die Zeit wurde knapp und wir mussten fertig werden. :rolleyes:

Und ich kann nur sagen, der Versuch ging total schief. Es kam keine Auftrennung der Proteine zustande. Die Bromthymolblaufront ist zwar nach unten gewandert, aber mehr ist auch nicht passiert. :(
Und jetzt sind wir ratlos, woran das liegen könnte. :confused:
Eine Vermutung wäre, dass die Fixierung nicht so richtig geklappt hat.

Wie stellst du denn die Fixierlösung her?
Wir haben eine 20%ige wässrige Trichloressigsäure verwendet und haben dann für 2 min in einem Wasserbad mit 50°C fixiert.

Wäre toll wenn du mir nochmal helfen könntest :)

Milka

ehemaliges Mitglied
20.06.2002, 12:10
Wozu denn extra fixieren? In der Coomassie-Färbelösung sind doch 30-40 % Methanol und 10 % Eisessig, das reicht dicke zum Fixieren.
Und nochmals: Welche Spannung erreicht Ihr bei 40 bzw. 50 mA? 300 V ? Oder habt Ihr die begrenzt? Oder zusätzlich die Leistung? Sagte ich bereits, daß zu hohe Ströme (bzw. Leistungen) nicht gut sind, weil das Gel zu warm wird? :mad: Das ist nunmal so, auch wenn die Zeit drängt, kann man nicht beliebig zulegen!
Ich würde Euch empfehlen, das Gel morgens vor Unterrichtsbeginn zu laden (so arg lange kann das bei ein paar Proben nicht dauern, man kann die auch längere Zeit vorher vorbereiten und einfrieren; einfach vor dem Auftragen kurz nochmal auf 95 °C erhitzen). Den Laufpuffer habt Ihr sicher auch schon vorher fertig angesetzt. Dann laßt Ihr das Gel bei geringerer Stromstärke, z.B. 10 mA oder so, laufen. Wenn es dann zur betreffenden Unterrichtsstunde noch nicht weit genug ist, könnt Ihr ja noch einige Zeit die Stromstärke erhöhen (25 mA). Dann färbt Ihr so ca. 30 min mit der Coomassie-Lösung. Entfärben könnt Ihr z.B. über Nacht. Das ständige Wechseln des Entfärbers kann man sich sparen, wenn man ein fusselfreies Papiertaschentuch dazu gibt, das den Farbstoff adsorbiert. Wenn's zu stark entfärbt ist, macht es nichts, man kann es ja nochmal neu färben. By the way: Der Farbstoff im Ladepuffer ist BromPHENOLblau, oder ist das bei Euch anders?
So, dann mal viel Erfolg! :rolleyes: Halt mich weiter auf dem Laufenden!

Milka25
21.06.2002, 19:34
Also der Strom war limitierend (40 mA und nach ca. 50 min 50 mA). Die Spannung betrug bei Versuchsende 175 V.

Du hast Recht bei uns ist auch Bromphenolblau als Farbstoff drin. (hatte mich verschrieben. Sorry!) :uh:

Das Gel hatte ich über Nacht in ein Wasserbad gelegt. Als ich heute morgen nachgesehen habe, habe ich doch noch ein paar ganz schwache Banden entdeckt. Da ich heute keine Zeit mehr hatte es nochmals zu Färben, habe ich das Gel mit dem Wasserbad in den Kühlschrank gestellt. Ich werde das Gel am Montag nochmal färben, mal schauen was passiert. Falls das Gel natürlich das Wochenende überlebt hat. Aber eigentlich dürfte doch im Kühlschrank nichts passieren oder?


Beim nächsten Gel werde ich deine Ratschläge berücksichtigen!
:)

Milka