Restriktionsenzyme

[nobody]

Also ich habe ein kleines grosses Problem. In der Uni soll ich einen Versuch durchführen, bei dem Hilfe von Bacteriophagen, Restriktionsenzymen und Ligasen DNA in ein Bakterienplasmid gebracht werden soll. Mir ist ja schon vieles klar an diesem Versuch, doch fehlt mir noch die Funktionsweise der Restriktasen.

Ich wäre euch sehr dankbar, wenn irgendjemand auch nur ein bischen darüber weiß.

Bis denne
kristina:confused:

[Kutti]

Ich habe mir für dich mal eine kleine Zusammenfassung über Restriktionsenzyme überlegt:

- 1969 in Bakterien entdeckt - stiessen das Tor zur Gentechnik auf

- Enzyme, die die DNA gezielt entsprechend der Basensequenz spalten können

- Restriktionsenzyme sind also natürlichen Ursprungs - ihre Aufgabe im Bakterium: Spaltung artfremder DNA zum Schutz des eigenen Organismus

- jedes bisher isolierte Enzym hat "seine" Schnittstellensequenz; die Länge der Erkennungsstellen kann variieren; die Basenanordnung einer Schnittstelle ist kreuzweise spiegelbildlich (Palindrom)

- man unterscheidet bei den mehreren hundert bisher entdeckten Restriktionsenzymen verschiedene Schnittarten:
1. Schnitte, die zu überstehenden DNA-Enden führen, dies sind die "
sticky ends" (klebrige Enden)
2. glatte Schnitte, die keine überstehenden Enden der DNA liefern;
das sind die "blunt ends"

Beispiel für "sticky ends": das Restriktionsenzym EcoRI
Beispiel für "blunt ends": das Restriktionsenzym Hae III

-> Zur Namensgebung: richtet sich nach dem Organismus, aus dem das Enzym isoliert wurde; die römische Ziffer gibt an, als wievieltes Enzym dieses Organismus das Enzym isoliert wurde.
Bsp.: EcoRI ist das erste Restriktionsenzym aus dem Bakterium E.coli.
-> bei den "sticky ends" fällt auf: nach einem Schnitt mit dem entsprechenden Restriktionsenzym (z.B. EcoRI) lagern sich DNA Stücke verschiedener Herkunft (Pflanze, Tier, etc.) aufgrund der Komplementarität der Schnittstellen vorzugsweise zusammen.

-> Restriktionsenzyme gehören zu den wichtigsten Werkzeugen der
Gentechnik; Grund:

Will man die DNA in kleine Stücke zerlegen, kann man den DNA-Faden regelrecht zerbrechen (Scherkräfte), z.B. durch Aufsaugen der DNA-Lösung durch hochfeine Kapillaren oder durch Ultraschall - dies bedeutet aber eine völlig unspezifische Zerkleinerungsmethode, da zufällige, undefinierte Bruchstücke erzeugt werden. Die Restriktionsenzyme hingegen erlauben ein definiertes Schneiden von DNA wodurch definierte DNA-Stücke mit bestimmter Länge und bekannter Endsequenz entstehen. Aufgrund der sequenzspezifischen Schnittstellen erhält man interessante Einblicke in die Struktur der DNA -> Klonierung von rekombinierter DNA

Falls du explizite Fragen hast, oder dir irgendetwas unklar ist, immer nachfragen ! ;)

[nobody]

Nach langem Suchen habe ich diesen Thread gefunden. Kutti, wärst du so nett mir auch zu helfen: Mit welchen Methoden kann mit die Lage von Restriktionsschnittstellen ermitteln bzw. überprüfen?

Danke!
Nic

[TNT]

@Kristina was studierst Du denn?

@Michael Indem man spezifisch Restriktionsenzyme und bekannt DNA Sequenzen mit bekannten Sticky Ends zugibt oder mit PCR...

Gruss
die TNT

[nobody]

Tut mir echt leid, TNT - aber ich verstehe es immer noch nicht. Kannst du es vielleicht ein bisschen weiter ausführen??

[nobody]

@Michael

wenn Dir die Sequenz des zu untersuchenden Genabschnitts bekannt ist kannst Du sie unter folgender Adresse virtuell mit allen bekannten Restriktionsenzymen schneiden lassen.

NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)