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Archiv verlassen und diese Seite im Standarddesign anzeigen : Statistische Auswertung von HPLC Kalibrierung


ehemaliges Mitglied
08.08.2009, 22:04
Hallo,

ich muss für eine Konzentrationsbestimmung eines Arzneistoffs eine Kalibrierung mit HPLC durchführen.

Dazu habe ich vier Konzentrationsniveaus, die jeweils 3-fach injiziert werden.

Desweiteren muss ich den Konzentrationsbereich ( wieder mit 4 Konz.niveaus) der Standardlösungen erweitern, sowie Auftragsmenege auf die Säule und Injektionsvolumen variieren.

Für die Auswertung habe ich mir folgendes überlegt:

- rel. Standardabweichung, Mittelwert, Korrelationskoeffizient
Wiederfindungsrate von jeder 3-fach Injektion bzgl. Retentionszeit und
Peakfläche
- Ausreisertest
- Vergleich der Steigung und Linearität (R^2) der Standardverdünnungsreihen
- Vielleicht 1.Ableitung der Kalibriergerade?

Mehr fällt mir leider nicht ein.
Was kann ich noch einbringen?

beste grüße

bm
08.08.2009, 23:22
- Vielleicht 1.Ableitung der Kalibriergerade?

Zweck der Übung?

ehemaliges Mitglied
09.08.2009, 11:19
Zweck der Übung?

Somit kann ich die Konstantheit der Steigung der Geraden sehen.
Was denken Sie darüber?

Haben sie noch andere Vorschläge für eine Auswertung?

bm
09.08.2009, 12:04
y = mx + b
y' = m

ehemaliges Mitglied
09.08.2009, 16:59
Vielleicht ändert sich die Steigung im Bereich hoher bzw. niedriger Konzentration.

Noctum
09.08.2009, 17:51
Sollte sich die Steigung Verändern, hättest du keine Kalibriergerade mehr sondern eine Kalibrierfunktion, z.B. ein Polynom. Legst du aber eine Ausgleichsgerade durch deine Messpunkte, hast du faktisch überall eine konstante Steigung.

ehemaliges Mitglied
09.08.2009, 19:12
Sollte sich die Steigung Verändern, hättest du keine Kalibriergerade mehr sondern eine Kalibrierfunktion, z.B. ein Polynom. Legst du aber eine Ausgleichsgerade durch deine Messpunkte, hast du faktisch überall eine konstante Steigung.

HI,

ja genau das meinte ich.
Wenn man eine Verdünnungsreihe, für eine Konzentrationsbestimmung erstellen muss, sollte man mehrere Konzentrationsniveaus im höheren Konzentrationsbereich wählen um eine bessere Linearität zu erhalten?

Ich habe nämlich gelesen, dass es bei hohen Konzentrationen die Fehleranfälligkeit höher ist als im niedrigen Konz.bereich. Stimmt das?

viele grüße

Noctum
09.08.2009, 20:42
Wenn man eine Verdünnungsreihe zur Kalibration herstellt, sollte man vor allem den Bereich sinnvoll abdecken, in dem man später auch arbeiten möchte.

Was willst du denn mit der Methode erreichen? Lediglich Spurenanalytik? Oder eher die Quantifizierung einer Hauptkomponente? Danach richtet sich doch, was Sinn macht und was nicht.

Wie Fehleranfällig deine hohen Konzentrationen sind, das hängt damit zusammen, wie du sie Ansetzt. Eine generelle Aussage ist da schwer möglich

Gruß

ehemaliges Mitglied
09.08.2009, 21:57
Was willst du denn mit der Methode erreichen? Lediglich Spurenanalytik? Oder eher die Quantifizierung einer Hauptkomponente? Danach richtet sich doch, was Sinn macht und was nicht.

Es geht um die Quantifizierung eines Arzneistoffes. Aber erstmal soll ich verschiedene Verdünnungsreihen (4 Konz.niveaus und unterschiedlich hohe Konz.bereiche) statistisch analysieren.
Außerdem soll ich die Säulenauftragsmenge erhöhen.

Hast du noch andere Ideen, als die von mir oben angegeben?

bm
09.08.2009, 23:09
Üblicherweise macht man n Standardkonzentrationen:

Standard n wird x mal eingespritzt. Das gibt die Reproduzierbarkeit.

Alle n werden eingespritzt, ggf. mehrmals. Das ergibt die Linearität.

Von einer Wiederfindungsrate spricht man, wen der Analyt aus einer Matrix heraus analysiert werden soll.

Stichworte: Standardadditionsvefahren, externer/interner Standard.

ehemaliges Mitglied
10.08.2009, 14:31
Um die Qualität einer Kalibriergerade visuell zu überprüfen, ist die Berechung der Residuen hilfreich.

Residuen (berechnet für jeden einzelnen x-Wert) = (aus der Kalibrierfkt. berechneter y-Wert) - (exp. ermittelter y-Wert)

Im günstigsten Fall streuen alle Residuen gleichmäßig um Null.

siehe auch :
http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/16/bbz/bbz_appletaddin.vlu/Page/vsc/de/ch/16/bbz/bbz_appletaddin_start.vscml.html

[Applet starten; Beispielwert laden: Kalibrierdatensatz 1; Berechnung; Residuen angucken]

ehemaliges Mitglied
11.08.2009, 10:22
Wie berechne ich in meinem Fall die Wiederfindungsrate?Ich habe vier Konzentrationsniveaus mit jeweils drei Einspritzungen.

bm
12.08.2009, 08:15
Von Wiederfindungsraten spricht man, falls die Analyse auf einer Matrix heraus erfolgt und Analyt verloren geht.

http://de.wikipedia.org/wiki/Wiederfindungsrate

ehemaliges Mitglied
12.08.2009, 09:52
Von Wiederfindungsraten spricht man, falls die Analyse auf einer Matrix heraus erfolgt und Analyt verloren geht.



Also ich mache eine Messung mit einer Probe und erhalte eine bestimmte area.Dann errechne ich mithilfe der Geradengleichung die Konzentration dieser Probe, dividiere sie durch meine errechnete Konzentration am Anfang und multipliziere mit 100?

Alchymist
12.08.2009, 10:04
Also, ich versuche mal zusammenzufassen, was du IMHO machen willst und wie du das erreichen kannst.
Du sollst eine HPLC-Methode zur Bestimmung eines Arzneistoffes validieren. Die zu validierenden Parameter sind
1. Linearität (ist die Kalibrierfunktion linear bzw. über welchen Konzentrationsbereich ist sie das)
2. Präzision (Wiederholbarkeit der Messung)
3. Richtigkeit = Wiederfindung
4. Robustheit (bezüglich Änderung des Injektionsvolumenes)


Du erstellst also zunächst eine Reihe von Standards, injizierst diese und berechnest die Kalibrierfunktion. Wenn du über einen großen Bereich, d.h. mehr als eine Zehnerpotenz, kalibrierest, wäre eine Bestimmung der Varianzhomogenität, d.h. der Varianzen des niedrigsten und des höchsten Kalibranten sinnvoll. Sind diese sehr verschieden (was bei einem großen Kalibrierbereich sehr wahrscheinlich ist, da i.d.R. die relative Abweichung gleich bleibt, die absolute daher bei hoher Konzentration größer ist) muss eine [B]gewichtete Regeression durchgeführt werden.

Die Wiederfindungsrate erhälst du, indem du die Matrix, die hinterher untersucht werden soll (z.B. aufgelöste Tabletten) mit dem Standard ausfstockt. Durch eine mehrfache (z.B. 5fache) Injektion der aufgestockten Matrix erhälst die Präzision (aus der relativen Standardabweichung).

Die Robustheit untersucht, welchen Einfluss Veränderungen der Methode auf das Ergebnis haben. Wenn du das Injektionsvolumen z.B. von 10 bis 50 µL variierst und das Injektionsvolumen gegen die Peakfläche aufträgst, siehst du, ob hier ein linearer Zusammenhang besteht.

Man kann natürlich weitere Parameter im Rahmen der Robustheit prüfen, z.B. eine (geringfügige) Veränderung des Eluenten, eine andere Säulentemperatur.

Im pharmazeutischen Bereich ist das Vorgehen normalerweise durch entsprechende Regelwerke und durch hausinterne SOPs sehr genau festgelegt.

Eine internationale Richtlinie ist z.B. ICH Q2R1 (http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA417.pdf).

ehemaliges Mitglied
12.08.2009, 21:43
Vielen herzlichen Dank für die ausführlichen Antworten. Ich bin euch sehr dankbar.

Ich habe nun die meisten Kenngrößen bestimmen können. Während meiner Experimente sind mir folgende Sachen aufgefallen

Die Retentionszeit nimmt mit steigender Konzentration der Standardlösungen ab.
Wieso ist das so?

Ebenso habe ich festgestellt, dass die RT mit zunehmenden Alter des Fließmittel abnimmt. Da ich eine RP mache, heisst es, dass es polarer wird. Aus welchem Grund und wie kann man sowas vermeiden?

Sollte ich den Punkt (0/0) bei meiner Kalibriergeraden einbringen?Also bei einer Konzentration von 0 müsste theoretisch kein Signal kommen.

Bei einer hohen Säulenauftragsmenge (10 ug) werden die Peaks breit nicht mehr spitz. Sommit bekomme ich bei einer Auftragung der Säulenmenge gegen das Signal eine polynomische Funktion, bei der die Steigung kontinuirlich abnimmt und in den negativen Bereich rutscht. Um dies darzustellen habe ich die erste Ableitung gebildet

Ich habe noch Residualplots zu der Kalibration gebildet. Aber der Nutzen ist mir noch nicht so ganz klar geworden. Bei einer normalen Darstellung kann man doch auch sehr gut den Trend sehen . Wieso macht man solche Residualplots?

bm
12.08.2009, 22:11
Die Retentionszeit nimmt mit steigender Konzentration der Standardlösungen ab.
Wieso ist das so?

Überladungseffekt. Die Gleichgewichtseinstellung stationäre Phase/mobile Phase ist nicht mehr gewährleistet. Führt auch zur Peakverbreiterung.

ehemaliges Mitglied
13.08.2009, 00:33
Überladungseffekt. Die Gleichgewichtseinstellung stationäre Phase/mobile Phase ist nicht mehr gewährleistet. Führt auch zur Peakverbreiterung.

Und da kann man gar nichts machen?Wie siehts mit Änderung von verschiedenen Parametern wie Druck, Temperatur etc, aus?

bm
13.08.2009, 08:50
Es gibt dickere Säulen:

Alchymist
13.08.2009, 09:58
Ebenso habe ich festgestellt, dass die RT mit zunehmenden Alter des Fließmittel abnimmt. Da ich eine RP mache, heisst es, dass es polarer wird. Aus welchem Grund und wie kann man sowas vermeiden?
Das kann bzw. sollte eigentlich nicht sein. Wie ist denn dein Eluent zusammengesetzt? Verdampft/adsorbiert irgendein Bestandteil?
Sollte ich den Punkt (0/0) bei meiner Kalibriergeraden einbringen?Also bei einer Konzentration von 0 müsste theoretisch kein Signal kommen.
Du hast kein Basislinienrauschen oder sonstige Störungen? In der Regel sollte man die Kalibrierung nicht durch den Punkt (0,0) zwingen, dafür gibt es (i.d.R.) keine statistische Rechtfertigung.
http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/Column%3A+LC+Troubleshooting/Calibration-Curves-Part-I-To-b-or-Not-to-b/ArticleStandard/Article/detail/588090?contextCategoryId=9678

Bei einer hohen Säulenauftragsmenge (10 ug) werden die Peaks breit nicht mehr spitz. Sommit bekomme ich bei einer Auftragung der Säulenmenge gegen das Signal eine polynomische Funktion, bei der die Steigung kontinuirlich abnimmt und in den negativen Bereich rutscht. Um dies darzustellen habe ich die erste Ableitung gebildet
10µg klingt recht viel - hängt aber davon ab welche Dimension deine Säule hat. Wertest du Peakhöhe oder -fläche aus? Die Fläche sollte unempfindlicher gegen Peakverbreiterung sein. Darüberhinaus hängt die Peakverbreiterung von der Lösungsmittelstärke der Probenlösung ab. Sie sollte kleiner oder gleich der des Eluenten sein.

Ich habe noch Residualplots zu der Kalibration gebildet. Aber der Nutzen ist mir noch nicht so ganz klar geworden. Bei einer normalen Darstellung kann man doch auch sehr gut den Trend sehen . Wieso macht man solche Residualplots?
Damit kann man deutlich besser erkennen ob die Abweichungen von der Kalibrierung einen Trend haben. Du kannst außerdem noch ausrechnen, ob die Residuen normalverteilt sind um die Gültigkeit der Kalibrierfunktion nachzuweisen.
http://www.chemieonline.de/forum/attachment.php?attachmentid=17190&stc=1&d=1250146554
aus "Statistik fur Chemiker Ein ” Kochbuch“ (http://cocoon.ifs.tuwien.ac.at/info/statistik/statistik_fuer_chemiker.pdf)"

ehemaliges Mitglied
13.08.2009, 12:27
Wie ist denn dein Eluent zusammengesetzt? Verdampft/adsorbiert irgendein Bestandteil?



Der Eluent besteht aus ACN und H20.

Ich habe die Kalibrierung mehrmals an der gleichen Maschine durchgeführt um meine Arbeitsweise zu testen, also Präzision. Mit welchen statistischen Kenngrößen sollte man dies vergelichen? Und welche Eigenschaften beider Kalibriergeraden sollte man vergleichen (Steigung, Bestimmtheitsmaß etc.)

Weiter ist mit aufgefallen dass meine Wiederfindung (muss theoretisch 100% sein), von der am niedrigsten konzentrierten Standardlösung bis zur höchsten konzentrierten Standardlösung, abnimmt.
Warum dieser Trend?

ehemaliges Mitglied
13.08.2009, 15:51
Bei der Durchführung der gleichen Kalibration an zwei unterschiedlichen Anlagen bekomme ich deutliche Unterschiede bzgl. der Wiederfindung!
Wer kann mit das erklären?

Alchymist
14.08.2009, 11:39
Dass die Wiederfindung bei niedrigen Konzentrationen geringer ist als bei hohen, würde ich als normal ansehen. Matrix- und Adsorptionseffekte wirken sich bei niedrigen Konzentrationen nunmal stärker aus. 100,00% Wiederfindung zu erwarten ist unrealistisch. Im Spurenbereich ist man bei 80% schon zufrieden.
Was die Unterschiede deiner beiden Anlagen angeht ist das mit den gegebenen Informationen nicht zu beantworten. Worin unterscheiden sie sich? Wie hoch sind die Unterschiede der Ergebnisse?

ehemaliges Mitglied
14.10.2009, 13:44
Dass die Wiederfindung bei niedrigen Konzentrationen geringer ist als bei hohen, würde ich als normal ansehen. Matrix- und Adsorptionseffekte wirken sich bei niedrigen Konzentrationen nunmal stärker aus


Was genau sind diese Matrix-und Adsorptionseffekte?Wie kann man diese Effekte kompensieren, so dass man eine höhere Wiederfindung bekommt?Gibt es zu dazu vielleicht einen guten wissenschaftlichen Artikel?

Alchymist
19.10.2009, 12:04
Matrixeffekte: Effekte die durch andere Bestandteile der Analysenlösung hervorgerufen werden. Also mitexrahierte Bestandteile der Probenmatrix. Je nach dem, was für eine Matrix vorliegt, können die unterschiedlicher Art sein: Störungen durch koeluierende Bestandteile, Ionenpaarbildung, pH-Wert-Veränderung etc etc. Abhilfe schafft eine entsprechende Probenvorbereitung (z.B. SPE).

Adsorption: entsprechend "klebrige" Substanzen können überall adsorbieren: an den Glasgeräten, die zur Probenvorbereitung benutzt wurden, an Autosampler-Vials, am Injektionssystem, an der Säulenpackung... Ein Patentrezept dagegen gibt es nicht. Man kann versuchen silanisierte Glasgeräte und Vials einzusetzen, das hilft aber auch nicht immer.

Es gibt sicherlich auch einen Haufen Literatur über Matrixeffekte - ich kenne jetzt bloß aus dem Stehgreif keinen über HPLC-UV. Ich habe hier ein paar über Matrixstörungen in der ESI-MS liegen...

ehemaliges Mitglied
19.10.2009, 20:49
Hi Alchymist,

Danke für deine Antwort. Also als Matrix habe ich Fließmittel benutzt (0.1% TFA in ACN). Könnten da irgendwelche Effekte auftreten?

Die Vials waren aus PEG.

gruß

Alchymist
20.10.2009, 12:16
Das Laufmittel gibt normalerweise keinen Effekt, wenn die Lösungsmittel von entsprechender Reinheit sind (und deine Substanz nicht gerade säureempfindlch ist?). Was (evtl.) einen Effekt gibt sind Begleitsubstanzen - du hast doch eine Arznei, die außer dem Wirkstoff noch anderes enthält.
Um sich nicht in Spekulationen zu verlieren, wenn du gezielt Hilfe brauchst poste doch mal:
- genaue Analysenbedingungen (Laufmittel, Säule, Temperatur, Injektionsvolumen ...)
- Analyten
- Probenvorbereitung
- Chromatogramm(e), Kalibrierkurve
oder schick sie mir, wenn es zu geheim für Forum ist.